尹华阳，董广平*
（1.松材线虫病预防与控制技术国家林草局重点实验室，安徽 合肥 230031；
2.安徽省林业科学研究院，安徽 合肥 230031）
松材线虫病又称松树萎蔫病，是一种由松材线虫对易感松树寄生、取食引起其死亡的病害，由于其发病快、致死率高，被称为松树的“癌症”[1-2]。我国于1982年在南京中山陵的松林中首次发现松材线虫病，短时间内快速蔓延至多个省市，引起松林大片枯死，给我国松林资源造成了巨大的损失，并且随着松材线虫适应力的增强，松材线虫病逐渐开始向高海拔或低温地区松林蔓延，对我国的生态安全造成了严重的威胁[3-4]。目前松材线虫病防控采用以清理病死松树为核心，以媒介昆虫防治、打孔注药等为辅助的综合防治策略[5]。其中，打孔注药具有简便、高效、持效期长的优点，是一种被广泛使用防治松材线虫病的手段。
阿维菌素和甲维盐是两种被广泛应用于松材线虫病防控的药剂。阿维菌素是由土壤链霉菌（Streptomyces avermitilis）发酵产生的十六元大环内酯类化合物，对虫、螨、线虫等具有高效低毒广谱的生物活性[6]；
其有多个同系物，其中阿维菌素B1a具高活性、低毒性优势，是主要的产业化对象[7]。甲维盐是美国Merck公司以阿维菌素B1a和B1b同系物加工获得的衍生物，实验室内杀虫活性数倍于天然阿维菌素且对哺乳动物有更低的毒性[8-9]。研究表明，阿维菌素和甲维盐是具有高效、持效期长、环境友好等优点的农药[10]，但关于两种药剂在实践中的对比研究报道较少。本研究采用阿维菌素和甲维盐对马尾松进行注干施药，测定药剂在树体不同部位的残留量，并通过人工接种松材线虫进行药效评价，以期为注干施药防治松材线虫病提供相关依据和实践经验。
试验林分位于安徽省滁州市全椒县瓦山林场（117°53′58"E，32°10′21"N），为马尾松纯林。该地马尾松树龄为30年，平均树高15 m，长势相差不大。
2.1 试验材料
2.1.1 药剂与试剂
阿维菌素标准品（纯度95%）和甲维盐标准品（纯度95%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
甲酸、甲醇、乙腈、二氯甲烷和乙酸铵，均为色谱纯（购自国药集团化学试剂有限公司）；
3%甲维盐微乳剂（安徽森科生物科技有限公司）、3.2%阿维菌素乳油（杭州益森键生物科技有限公司）。
2.1.2 仪器设备
液相色谱-串联质谱仪（三重四级杆串联质谱、ESI电喷雾离子源）；
旋转蒸发仪；
涡旋仪；
电子天平；
超声波脱气仪；
移液器等。
2.1.3 色谱-质谱条件[11]
（1）色谱条件
色谱柱型号为：赛默飞Hypersil GOLD HPLC C18（100 mm×2.1 mm，5 μm)；
流动相：A相甲醇为0.1%甲酸，B相为0.2%乙酸铵；
柱温：30℃；
进样量：10 μL；
流速：150 μL/min；
运行时间：10 min。
（2）质谱条件
电喷雾离子源、正离子采集、传输管温度为270℃、喷雾电压3 000 V。甲维盐的质谱参数为母离子质荷比886.2，子离子质荷比为82、157；
碰撞能量分别为45、33 eV；
阿维菌素的质谱参数为母离子质荷比890.7，子离子质荷比为307、567；
碰撞能量分别为22、13 eV。
2.1.4 试验虫源
试验用松材线虫来自松材线虫病预防与控制技术国家林草局重点实验室鉴定保存的虫株HN。松材线虫在长满灰葡萄孢（Botrytis cinerea)的PDA培养基上继代培养，待将菌丝消耗完毕后，采用Berman漏斗法分离松材线虫[12]，用离心机低速离心浓缩制备10 000条/mL的线虫液备用。
2.2 试验方法
2.2.1 注干施药
2020年3月，在试验地选取树高、胸径相近的马尾松，按照厂家说明，在距树基部1 m处用手电钻斜向下45°打孔，插入开孔的药瓶，在尾部扎透气孔，并于10 min后确认无药剂漏出。每种药剂各注干10株马尾松，每株马尾松施用1瓶（50 mL）药剂。设置对照组，以相同方法注入50 mL无菌水。悬挂标识牌并记录。
2.2.2 药剂含量标准曲线的建立
称取10.0 mg阿维菌素或者甲维盐标准品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 mg/L母液，再逐级稀释成0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L标准溶液后进样分析。以浓度为横坐标，质谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
2.2.3 加样回收率测定
分别以马尾松木屑和松针为基质检测加样回收率。取马尾松木段粉碎过筛后，向木屑中加入阿维菌素或者甲维盐标准品，加入量分别为0.1、0.5、5.0、10.0 mg/kg。称取10 g样品，加入20 mL乙腈，震荡混匀2 min，5 000 r/min离心10 min，取10 mL上层有机相70℃水浴下氮气吹干，加入3 mL甲醇复溶，再加入2 mL去离子水混匀，过0.2 μm有机滤膜，Carb/NH2小柱过滤，LC-MS/MS检测。另外，取马尾松松针，液氮冷冻后粉碎加入标准品，余下操作同上。
2.2.4 树体内药剂残留量测定
注干施药6个月和18个月后，取打孔位置上方1 m处木质部样品，并剪取树冠处枝条收集松针样品。按照“2.2.3”方法进行提取纯化，在“2.1.3色谱-质谱条件”下对药剂残留量进行检测。
2.2.5 效果评价试验
2020年8月，对试验组和对照组的马尾松全部接种松材线虫，每株马尾松接种10 000条松材线虫，定期观察发病情况，按照以下公式计算发病率，评价防治效果。
式中，D为防治效果，Dc为对照组松树发病率，Dt为注干施药区松树发病率。
3.1 标准曲线与定量下限
对配制的标准溶液（0.01～5.0 mg/L）进样检测，以质量浓度为横坐标x、峰面积为纵坐标y绘制标准曲线。阿维菌素的线性回归方程为y=7.599x+13.214，相关系数为0.995 6；
甲维盐的线性回归方程为y=9.654x-1.359，相关系数为0.998 9。相关系数均大于0.995，说明该方法下阿维菌素和甲维盐在0.01～5.0 mg/L范围内，具有良好的线性关系。以样品检测质谱图空白平稳处信噪比（s/n）的10倍作为定量下限，测得阿维菌素和甲维盐的定量下限为0.002 mg/L。
3.2 加样回收率
按照试验方法分别检测药剂样品马尾松木屑和松针中的加样回收率，4个浓度水平各重复测定5次。测得阿维菌素在木屑中的回收率范围为79.61%～86.44%，相对标准偏差（RSD）范围为1.55%～3.98%；
在松针中的回收率范围为82.40%～86.64%，相对标准偏差（RSD）范围为1.01%～3.29%。测得甲维盐在木屑中的回收率范围为82.05%～86.36%，相对标准偏差（RSD）范围为2.03%～3.34%；
在松针中的回收率范围为84.81%～87.64%，相对标准偏差（RSD）范围为1.20%～4.22%（见表1）。两种药剂各加样浓度在马尾松木屑和松针中的回收效果较好，总体标准偏差较小，说明本检测方法可以检测阿维菌素和甲维盐残留量。
表1 加样回收率试验结果（n=5）
3.3 注干后药剂残留情况
注干施药6个月后，施用3%甲维盐微乳剂处理，在马尾松木质部和松针中均能检测到甲维盐残留；
在木质部中的平均浓度为28.743±9.855 mg/kg，在松针中的平均浓度为9.997±3.125 mg/kg。施用3.2%阿维菌素乳油处理，在马尾松的木质部能检测到阿维菌素残留，平均浓度为19.861±3.770 mg/kg，但有7株松树松针质谱峰低于检测限值，无法测量。18个月后，施用3%甲维盐微乳剂处理，在木质部和松针中还能检测到甲维盐残留，但浓度已明显降低；
在木质部的平均浓度为10.233±4.217 mg/kg，在松针中的平均浓度为2.189±0.965 mg/kg。施用3.2%阿维菌素乳油处理，在马尾松的木质部中残留量为3.920±2.987 mg/kg，松针中残留量已无法测量（见表2）。
表2 注干施药后甲维盐和阿维菌素残留浓度
3.4 两种药剂的防治效果评价
在接种松材线虫3个月后，无菌水注干的对照处理马尾松林部分出现针叶萎蔫枯黄的发病症状，发病率为60%，并且随着时间增长不断升高，至接种6个月后全部发病。两个施药处理在接种松材线虫13个月（即注干施药后18个月）内的防效为100%，但在15个月时（即注干施药后20个月）均开始发病，至接种19个月（即注干施药后24个月）后，3.2%阿维菌素乳油的防效为60%，3%甲维盐微乳剂的防效为80%（见表3）。
表3 两种药剂注干施药的防治效果
目前，松材线虫病防治注干药剂产品基本以甲维盐和阿维菌素为有效成分，剂型以乳油和微乳剂居多。黄俊等[13]对马尾松注干施用1%阿维菌素微囊剂，结果证明药剂效果显著，施药区病死率低于2%。李桥等[14]研究证实，以甲维盐、阿维菌素、啶虫脒为主要成分的药剂注干马尾松防治效果在80%以上，甲维盐施药1年后树体内仍有残留。李长强等[15]对黑松注干施用甲维盐微乳剂，注药2年后，在注干点以上不同部位仍能检测出甲维盐残留；
接种松材线虫1.5年后，按松树地径2 mL/cm注入甲维盐处理的防效为91.7%。这些研究均证明了注干药剂对松材线虫病防治的显著效果，但未见针对药剂主要成分和剂型进行对比评价研究。本研究以阿维菌素和甲维盐为有效成分的两种不同剂型注干药剂对马尾松进行注干施药，利用LC-MS/MS检测方法探究了两者在树体内的动态残留量。结果表明，施用3%甲维盐微乳剂18个月后，在马尾松木质部和松针中还能检测到甲维盐残留，也间接证实了李长强等的研究结果，甲维盐对松材线虫有长效的毒力[16]；
3.2%阿维菌素乳油注干6个月后在松针中已不能检测到药剂残留，在注干18个月后的木质部残留量明显降低，这可能与阿维菌素乳油粒径较大、面张力低、树体内传导效果较差等因素相关[17]。另外，对处理组和对照组马尾松人工接种松材线虫进行药效评价。结果表明，两种药剂注干施药后18个月内可有效防止松材线虫病的发生，其中3.2%阿维菌素乳油防效在注干施药24个月时降低明显。分析认为造成这种情况的原因：一方面甲维盐的理论毒性更高；
另一方面，微乳剂相较于传统乳油有更长的持效期，在树体内可能有更好的传导效果。
本试验还对甲维盐和阿维菌素的LC-MS/MS检测方法进行了探索，在该方法下阿维菌素和甲维盐在0.01～5.0 mg/L范围内具有良好的线性关系，在松针和木屑中的加样回收率大于79.61%，相对标准偏差小。说明该方法适用于松树中阿维菌素和甲维盐残留量的检测。
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