杨 卓 熊 辉 沈 浮 袁 博 方 萍 齐新宇 段建辉 贺渊哲
(1 常德市第一中医医院，常德，415000；
2 湖南中医药大学，长沙，410208；
3 湖南中医药大学第一附属医院，长沙，410007)
股骨颈骨折(Femoral Neck Fracture)是临床常见的骨科疾病，随着经济社会发展和交通意外增加，股骨颈骨折发生率正逐年攀升，骨折延迟愈合和不愈合是骨科医师面临极具挑战性的临床问题[1-2]。目前，股骨颈骨折占成年骨折的3.6%，好发于中老年人群[3]。临床常根据Garden分型按骨折的移位程度分为4度，Ⅰ型为不完全骨折，Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型均为完全骨折[4-5]。对于GardenⅠ型和Ⅱ型的骨折患者可采用保守治疗或闭合复位内固定术，而GardenⅢ、Ⅳ型股骨颈骨折的老年患者常采用髋关节置换术[6-7]。
目前，股骨颈骨折的疗效已明显提高，但骨折不愈合发生率和股骨头坏死发生率仍较高，如何促进骨折愈合、避免股骨头坏死依然是临床医师面临的重要难题。中医药对于促进骨折修复有着独特优势[8-11]，根据中医理论体系采用三期辨证论治用药，对促进骨折愈合和损伤修复起到重要作用。骨折初期主要治以活血化瘀，桃红四物汤源自于《医宗金鉴》，由桃仁、红花、当归、白芍、熟地黄、川芎6味药组成，是中医骨伤科“活血祛瘀”法治疗骨折初期的基本方。有研究发现，桃红四物汤可促进骨痂中血管内皮生长因子、转化生长因子-β1、核因子κB受体激活蛋白配体、白细胞介素-1等细胞因子的表达,调控骨髓间充质干细胞迁移、归巢、定向分化[12-15]，促进成骨细胞分化和延缓破骨细胞凋亡，促进血管新生和骨折愈合。
由于桃红四物汤的药物组成较多，所含各类成分复杂，作用靶点相对广泛，通过动物实验、细胞实验难以系统阐明其具体的作用机制。网络药理学的发展，集合药理学、生物信息学等多学科领域知识，可有效系统性地从整体水平来揭示中医药治疗股骨颈骨折的潜在作用分子机制。因此，本文将通过网络药理学来寻找桃红四物汤治疗股骨颈骨折的有效作用成分、核心靶点及发挥作用的相关通路，为临床治疗股骨颈骨折提供理论依据及中医药研究骨折全新的方向。
1.1 材料
1.1.1 数据库及软件 中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)、GeneCards数据、Uniprot数据库、STRING蛋白数据库、Cytoscape-3.7.0(CentiScape插件)、R语言3.6.2程序(Bioconductor等数据包)。
1.2 方法
1.2.1 桃红四物汤药物活性成分筛选及潜在靶点 检索中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，标准设置为口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18，通过筛选得到桃红四物汤有效活性成分，以及其对应靶点，再通过Uniport数据库将作用靶点名来进行数据注释。
1.2.2 桃红四物汤活性成分-靶点模型建立 通过Gene Card数据库，将桃红四物汤的活性成分与其治疗股骨颈骨折的潜在作用靶点导入Cytoscape-3.7.0软件，构建“活性成分-靶点”网络，并对该网络进行分析。
1.2.3 交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)及核心靶蛋白预测 将桃红四物汤治疗股骨颈骨折的潜在靶点导入STRING数据库，限定物种设置为“human”，检索获取到PPI关系，并导入到Cytoscape-3.7.0软件进行可视化分析，计算平均度值(Degree)的中位数，再以2倍度值的中位数为标准来筛选核心PPI靶蛋白。
1.2.4 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 进一步分析桃红四物汤治疗股骨颈骨折的生物学过程，通过R语言3.6.2程序，利用“bioconductor”数据包来获得信息，将桃红四物汤涉及的靶点进行GO与KEGG通路富集分析，根据富集基因数目得到前20条通路进行可视化展示。
1.3 动物实验验证
1.3.1 动物 选用50只健康的无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级SD雄性大鼠，体质量(200±20)g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。所有实验动物全部实行分笼饲料喂养，饲养房相对温度15～25 ℃；
相对湿度50%～60%。所有大鼠均饮用蒸馏水，每笼的垫料需要更换1次/2 d。实验过程中大鼠的所有操作，严格遵循动物处置的相关伦理学标准。实验动物购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2020-0006。
1.3.2 药物 实验所使用的桃红四物汤需严格按照按《医宗金鉴》标准来配伍组方：桃仁20 g、生地黄20 g、赤芍20 g、当归20 g、红花10 g、川芎10 g(由湖南中医药大学第二附属医院中药房提供)。接骨七厘组采用湖南金沙的接骨七厘胶囊(每粒装0.26 g)。
1.3.3 试剂与仪器 鼠血管内皮生长因子试剂盒(上海泛柯实业有限公司，货号：F3055-B)、鼠PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)试剂盒(上海泛柯实业有限公司，货号：F3303-B)、鼠p-AKT(蛋白质激酶B)试剂盒(上海泛柯实业有限公司，货号：F40155-B)、4%多聚甲醛(宁波诺德生物科技有限公司，货号：NDP-1001A)、水合氯醛(上海浦山化工有限公司，货号：20151023)、光学显微镜(Motic公司，加拿大，型号：A210T)。
1.3.4 分组与模型制备 全部SPF级SD雄性大鼠都适应性喂养3 d后，再通过随机数字表将50只大鼠分成5组：正常组、假手术组、模型组、接骨七厘组和桃红四物汤组，每组10只。模型组、中药组及阳性药物组动物造模采用改良的开放截骨法。10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射将大鼠麻醉后，用手术刀将大鼠右大腿外侧作一长约2 cm纵切口，分离皮下组织并充分暴露股骨颈；
再使用骨锯沿着右侧股骨颈横向将其截断，并选择长度合适的克氏针固定，将术肢稍被动活动，确认复位成功，逐层缝合手术切口。假手术组大鼠只需要切开缝合不造模。
1.3.5 给药方法 术后第1天，桃红四物汤组和接骨七厘组开始实验进行药物干预，每日需要2次灌胃干预，早晚各1次，共需要连续灌胃10 d。给药通过计算公式换算：D鼠=D人×R鼠/R人(D为每天给药的剂量，R为动物与人体表面积比值系数)，得出桃红四物汤组每只大鼠每天灌胃量1.8 g，每只大鼠灌胃总量3 mL/d。接骨七厘组每只大鼠每天灌胃量18.72 mg，每只大鼠灌胃总量每日3 mL。正常组、假手术组和模型组需要予以3 mL/d的蒸馏水来灌胃，2次/d，灌胃共持续10 d。
1.3.6 检测指标与方法 苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色及酶联免疫吸附测定评估骨折愈合情况，使用HE染色法观察骨痂处的组织病理形态，将脱钙3周后的股骨样本，使用石蜡进行包埋，再使用石蜡切片机沿纵轴方向切片，厚度约为6 μm，通过烤干、脱蜡、染色、制作玻片标本等一系列步骤后，使用光学显微镜观察。为进一步验证网络药理学得出桃红四物汤治疗股骨颈骨折相关信号通路，使用酶联免疫吸附测定法测定血清中相关蛋白水平。
2.1 网络药理学结果
2.1.1 桃红四物汤活性成分 共得到桃仁的有效活性成分19个，红花12个，川芎6个，白芍5个，当归2个，熟地黄2个。见表1。对这些活性成分进行靶点预测得到靶点基因238个。
表1 桃红四物汤部分有效活性成分
2.1.2 股骨颈骨折与桃红四物汤交集靶点 股骨颈骨折发生的相关作用靶点共2 013个，与桃红四物汤有效活性成分的238个靶点相映射，最后得到交集靶点121个。见图1。
图1 桃红四物汤与股骨颈骨折初期交集靶点韦恩图
2.1.3 桃红四物汤“活性成分-靶点”网络 在有效成分节点排前5名(83、38、37、23、19)的是：槲皮素(MOL000098、Quercetin)、山柰酚(MOL000422、Kaempferol)、木犀草素(MOL000006、Luteolin)、黄芩素(MOL002714、Baicalein)、β-胡萝卜素(MOL002773、Beta-carotene)。在基因靶点节点组，排前5名(35、21、18、15、14)的是：PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AA1、PGR。“活性成分-靶点”网络见图2。
2.1.4 桃红四物汤PPI和核心靶蛋白 计算出平均度值(Degree)的中位数为17，再以2倍度值的中位数为标准来筛选核心PPI靶蛋白得到前10位的核心靶蛋白，依次是AKT1、MAPK-8、IL-6、JUN、MAPK-1、VEGFA、INS、EGFR、MTC、EGF、IL-1β、MMP-9、ESR-1。见图3。
图3 桃红四物汤PPI网络(A)及核心靶蛋白分布(B)
2.1.5 GO和KEGG分析 生物过程(Biological Process,BP)B分析数量较大主要是细胞对脂多糖、细菌来源分子、甾类激素、营养水平、氧化、活性氧等多种反应；
细胞组分(Cellular Component,CC)分析可以看出靶点主要涉及膜筏、膜区、膜微结构域、囊泡腔等；
分子功能(Molecular Function,MF)分析主要包括泛素蛋白连接酶结合、类固醇激素受体活性、磷酸酶结合、血红素结合、核受体活性等。见图4。
图4 桃红四物汤治疗股骨颈骨折初期潜在靶点的GO分析图
得到桃红四物汤治疗股骨颈早期相关性较大的信号通路是：KSHV信号通路、PI3K-AKT信号通路、AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。见图5。
图5 桃红四物汤主要活性成分治疗股骨颈骨折初期相关信号通路气泡图
2.2 动物实验验证结果
2.2.1 组织病理学结果 正常组和假手术组：骨组织均正常，骨皮质和骨干连续没有发生断裂；
模型组中可见少量软骨细胞和部分肉芽组织，未见骨小梁形成；
桃红四物汤组和接骨七厘组中均可见大量软骨细胞和肉芽组织，同时可见少量骨小梁形成。桃红四物汤可有效加速新生骨小梁的形成，加快成骨进程，从而有效干预骨折的早期愈合。见图6。
图6 术后第10天大鼠股骨病理学检查(HE染色，×100)
2.2.2 血清检测结果 桃红四物汤组和接骨七厘组血清中血清PI3K和p-AKT浓度均高于模型组(P<0.05)，接骨七厘组和桃红四物汤比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 血清PI3K和p-AKT浓度
骨折愈合分为初期、中期、后期，即：血肿炎症机化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期。中医骨伤科认为骨折愈合是一个“瘀去、新生、骨合”的过程，并提出骨折初期应治以活血化瘀。基于中医学“辨证论治”“整体观念”结合网络药理学，分析活血化瘀法代表方剂桃红四物汤治疗股骨颈骨折初期的具体作用分子机制，从系统生物学来全面分析中药方剂中发挥治疗作用的具体有效活性成分，从而为深入研究中药治疗骨折的分子机制及新药开发提供技术支持和理论支撑。
本研究结果显示：桃红四物汤治疗股骨颈骨折初期的有效成分主要有槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩素、β-胡萝卜素等39种。现代药理学研究发现，槲皮素可防止骨质流失，能显著增加骨矿化和成骨能力，增加Runt相关转录因子2、骨钙素和骨桥蛋白等特异性基因的mRNA表达水平[16]。有研究发现槲皮素促进了骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并可能通过miR-206/Cx43(间隙连接蛋白43)信号通路来调节。促进血管新生的作用；
山柰酚可以参与细胞因子的代谢，抑制细胞的凋亡和减轻缺血后再灌注损伤，其机制可能与激活PI3K-AKT信号通路相关[17]；
木犀草素具有抗纤维化、抗氧化、抗炎活性，与AKT1有很强活性，通过抑制白细胞介素-31的产生来促分裂原活化的蛋白激酶、核因子κB、JJun激酶、信号转导及转录激活因子3等因子的激活[18]；
黄芩素作为一种脂氧合酶可以增加骨痂的形成，对肌腱和骨具有促进作用，可能通过激活Wnt/β-连环素信号通路促进肌腱干细胞成骨分化，从而促进腱-骨愈合[19]；
β-胡萝卜素[20]有助于维持骨转换的正平衡，有效抑制骨密度的降低，提高细胞质护骨素基因的表达，保护人体的骨骼健康。
通过构建PPI网络图，我们得知蛋白激酶B-1、促分裂原活化的蛋白激酶-8、白细胞介素-6、Jun激酶、促分裂原活化的蛋白激酶-1、血管内皮生长因子A、表皮生长因子受体、白细胞介素-1β、基质金属蛋白酶-9、雌激素受体-1等核心蛋白是治疗股骨颈骨折初期的重要靶点。蛋白激酶B-1被磷脂酰肌醇依赖性激酶-1催化后，使结构域中的Ser124和Thr450发生磷酸化并完全活化，从而参与调节多个下游效应蛋白来促进细胞血管生成参与骨折愈合过程[21]。PI3K/AKT信号通路对成骨具有调节作用，促进成骨细胞的增殖与分化，可能与Wnt/β-连环素通路串扰发挥成骨作用[22]。促分裂原活化的蛋白激酶是信号转导调控的重要信号系统，包括胞外信号调节激酶、JUN和p38促分裂原活化的蛋白激酶。有研究表明促分裂原活化的蛋白激酶-1和促分裂原活化的蛋白激酶-8可阻碍破骨细胞的形成，减轻骨丢失，从而促进骨折初期的愈合[23]。白细胞介素-6、白细胞介素-1β是炎症介质，在骨折初期(即血肿炎症机化期)明显增高，有研究表明骨髓中的肥大细胞可通过促进破骨细胞形成(如组胺、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6)和抑制成骨细胞活性(白细胞介素-1β)来促进骨折的愈合[24]。血管内皮生长因子A和表皮生长因子受体均对细胞的生长增殖分化起重要作用，研究发现血管内皮生长因子可以促进血管新生和增加血管通透性，血管内皮生长因子A通过膜内化骨和软骨内骨化，有利于骨折初期修复过程中骨膜血管的快速生成和骨的形成[25]。
KEGG通路富集分析结果显示，桃红四物汤治疗股骨颈初期骨折主要涉及以下相关信号通路：PI3K-AKT、核因子κB、白细胞介素-17及TNF信号通路等。PI3K/AKT信号通路分布广泛，是细胞生长、增殖、分化的重要转导通路，是成骨细胞具有重要的调节作用。通过PI3K/AKT信号通路，骨折骨痂和小鼠成骨细胞MC3T3E1细胞中糖原合成酶激酶-3β在Ser9位发生磷酸化，并且β-连环素在Ser552位也发生了磷酸化，进一步激活下游β-连环素，参与成骨细胞的增殖与分化，而PI3K/AKT抑制剂LY294002实质上可以抑制骨折的愈合过程[26]。有研究发现巨噬细胞清道夫受体1介导的PI3K/AKT信号通路可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化的能力，并找到了其作用的靶基因是过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α。核因子κB是一类转录因子，对炎症和骨重建起到重要的调节作用，起到促进骨折初期(即血肿炎症机化期)愈合和防治骨质丢失的作用。有研究发现G蛋白偶联受体激酶2相互作用蛋白1可以影响骨髓间充质干细胞分泌血管生成因子，通过调节核因子κB信号通路来促进骨髓间充质干细胞旁分泌，促进血管生成和骨折愈合。核因子κB的激动剂核因子κB受体激活蛋白配体蛋白可以在成骨细胞中表达，促进成骨细胞的分化，而核因子κB抑制剂BAY 11-7082能够抑制骨折部位的前列腺素E2生物合成、碱性磷酸酶的活性以及骨形态发生蛋白-7表达，抑制骨折的愈合。对此，本研究团队推测桃红四物汤治疗股骨颈骨折初期可能通过调控PI3K/AKT信号通路促进血管内皮生长因子的表达和血管新生，继而改善成骨细胞分化来促进骨折愈合。进一步通过动物实验部分验证，得出桃红四物汤通过上调血清中PI3K、p-AKT的高表达，促进骨小梁的新生，从而有效促进大鼠骨折模型的早期愈合。
综上所述，本研究基于网络药理学及动物实验验证，初步探讨了桃红四物汤治疗股骨颈骨折初期的作用机制是桃红四物汤中多种有效活性成分来调控股骨颈骨折相关基因，通过调控基因再进一步影响多条信号通路，但具体机制的结论尚需要基础实验来进一步证实。基于网络药理学来挖掘中医药治疗骨伤疾病，从分子水平预测其具体作用机制，为中医“活血化瘀”法促进骨折修复愈合提供了全新的思路和作用靶点。
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