祝清灿，邹良梅，孙宜春，李慧馨，段 丽，石 亚
(国药集团同济堂[贵州]制药有限公司，贵州 贵阳 550026)
黑骨藤药材来源于萝摩科植物黑龙骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥根或全株，一般于秋、冬二季采挖，洗净，切段，晒干。黑骨藤收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)，为贵州少数民族用药，一般生长于海拔2 000 m以下的山地疏林向阳处、河谷地带、荫湿的杂木林下或灌木丛中，主要分布于云南、贵州、四川、广西、西藏和青海等省区，该药气微香，味苦，具有通经、活血、解毒及祛风等功效，用于风湿关节痛、跌打损伤和月经不调等[1-3]。黑骨藤主要有效成分包括强心苷类、甾类、三萜类、黄酮类、蒽醌类、苯丙素类化合物[4]。其中苷类及强心苷类，主要化学成分为杠柳毒苷(periplocin)、萝藦苷元(periplogenin)、8-羟基萝藦苷元(8-hydroxyperiplo-genin)、滇杠柳苷(periforside)、胡萝卜苷(daucosterol)等[5-7]。现代医学研究表明，黑骨藤具有抗炎、抗风湿、镇痛、抗肿瘤等药理作用[8-10]。近年来，国内外对于黑骨藤药理作用和临床应用的研究较多，但对其质量标准的研究较少，原先的标准项仅收载性状和理化鉴别项，不利于其质量控制。因此，贵州省药品监督管理局将黑骨藤纳入《贵州省中药材、民族药材质量标准研究》计划，本研究通过对黑骨藤进行显微鉴别和薄层色谱鉴别研究，按《中华人民共和国药典》规定的方法对水分、总灰分、浸出物进行测定，以期为质量标准的修订提供参考依据。
1.1 仪器
WHF-3型三用紫外分析仪(武汉药科新技术开发有限公司生产)；
CX41型显微镜(OLYMPUS CORPORATION)；
101-2A型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；
HH-4型数显恒温水浴锅[常州普天仪器制造有限公司(金坛市晶玻实验仪器厂)]，ME204TE/02型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]；
SB25-12DTS型数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2 试药
杠柳毒苷对照品(批号：111793-200901)，购自中国食品药品检定研究院；
三氯甲烷(批号：20170801)、乙酸乙酯(批号：2016071501)、硫酸(批号：20170301)、环己烷(批号：2016051901)、甲醇(批号：20161001)、乙醇95%(批号：20170901)均购自重庆川东化工(集团)有限公司；
三氯甲烷、乙酸乙酯、硫酸、乙醇、甲醇、环已烷等均为分析纯；
水为自制纯化水。
1.3 材料
硅胶G薄层板(批号：20170929)、硅胶G高效板(批号：20170831)均购自青岛海洋化工有限公司；
自制硅胶G薄层板(薄层层析硅胶用G，批号：0151008，200目，青岛海洋化工有限公司)。本研究所用样品均由国药集团同济堂(贵州)制药有限公司种植部提供，经贵州中医药大学药学院何顺志教授鉴定为萝摩科植物黑龙骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥根或全株。凭证标本存放于国药集团同济堂(贵州)制药有限公司。样品来源信息，详见表1。
表1 样品来源信息
2.1 显微鉴别
将样品(全株)粉碎(过四号筛)，经肉眼观察并制片置显微镜下观察。其特征为：本品粉末灰褐色；
木栓细胞多角形、类方形，内含黄棕色至红棕色物；
纤维多见，薄壁细胞含草酸钙方晶与纤维形成晶鞘纤维；
草酸钙方晶较多，散在或存在于薄壁细胞中；
石细胞类长方形、类圆形或椭圆形，单个或成群散在；
导管多为具缘纹孔，排列紧密，少见螺纹导管。
黑骨藤粉末显微特征，见图1。
注：1.木栓细胞；
2.晶鞘纤维；
3.草酸钙方晶；
4.石细胞；
5.导管。
2.2 薄层鉴别
2.2.1 供试品溶液制备 取本品粉末4 g，加水50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液[11]。
2.2.2 对照品溶液制备 取杠柳毒苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液[12]。
2.2.3 薄层鉴别方法与结果 按照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验[13]，分别吸取上述对照品溶液2～5 μL，供试品溶液3～7 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲苯(15∶5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，在105～110 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。黑骨藤薄层色谱，见图2。
注：1、2、4为供试品；
3、5为杠柳毒苷对照品。
2.3 水分含量测定
精密称取10批黑骨藤药材粉末(过二号筛)约4 g，按照2020年版《中国药典》(四部)通则“0832水分测定法”的第二法(烘干法)进行测定[13]，每批样品平行测定两份，取平均值。结果，10批样品中水分的含量最低为8.8%，最高为12.3%，平均值为10.35%，以平均测定值的120%设限，为12.42%，故建议将水分标准定为不得过13.0%。黑骨藤药材水分含量测定结果，见表2。
2.4 总灰分含量测定
精密称取10批黑骨藤药材粉末(过二号筛)各约2.5 g，按照2020年版《中国药典》(四部)通则“2302灰分测定法”的第一法(总灰分测定法)进行测定[13]，每批样品平行测定两份，取平均值。结果，10批样品中总灰分的含量最低为8.7%，最高为12.3%，平均值为10.25%，以平均测定值的120%设限，为12.3%，故建议将总灰分标准定为不得过12.5%。黑骨藤药材总灰分含量测定结果，见表2。
2.5 浸出物含量测定
取10批黑骨藤药材粉末(过二号筛)各约3 g，照水溶性浸出物测定法(《中国药典》2020年版四部通则2201)项下热浸法测定[13]，用水作溶剂，每批样品平行测定两份，取平均值。结果，10批样品中浸出物最低值为4.8%，最高值为7.2%，平均值为5.84%，以平均值的80%设限，为4.67%，故建议将浸出标准定为不得少于5.0%。黑骨藤药材浸出物含量测定结果，见表2。
表2 黑骨藤水分测定结果
3.1 开展本研究的必要性
黑骨藤药材质量标准收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准研究》(2003年版)，该标准中仅有性状、黑骨藤根的显微鉴别和理化鉴别，其显微鉴别为根的显微特征，由于黑骨藤药材来源于萝摩科植物黑龙骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥根或全株，故需对黑骨藤药材全株进行显微鉴别方法研究。同时，王强等[14]认为，原标准理化鉴别中使用3，5-二硝基苯甲酸试液、3，5-二硝基苯甲酸试液在配制和使用时有错误，其理化鉴别方法专属性不强，不能很好控制黑骨藤药材质量。因此，贵州省药品监督管理局将黑骨藤纳入《贵州省中药材、民族药材质量标准研究》计划，本研究开展了对黑骨藤质量标准的系统提升研究，以期为黑骨藤质量标准修订提供参考。
3.2 供试品溶液制备
根据化学成分的溶解性，分别对提取溶剂(水、甲醇、乙醇)，提取方法(超声、回流)，提取溶剂用量(15 mL、25 mL、35 mL)，提取时间(30 min、60 min、90 min)，样品取样量(1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g)等条件进行考察，结果表明，以本研究中制备方法制备的供试品溶液鉴别斑点最清晰。
3.3 薄层色谱条件考察
根据展开样品主要化学成分的极性，对展开系统如石油醚-三氯甲烷(1∶1.5)、正己烷-乙酸乙酯-甲酸(7.5∶5∶0.8)、三氯甲烷-甲醇-甲苯(15∶5∶0.5)、三氯甲烷-甲醇(10∶3、25∶1)，硅胶板(不同厂家)，点样量(2 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL)，薄层板预平衡时间(0 min、10 min、20 min)，展开温度(5 ℃、25 ℃、30 ℃)等进行了考察。结果表明，使用本研究中所用的色谱条件，展开效果较好，斑点清晰，伪品无相应斑点。
3.4 浸出物测定方法考察
在进行浸出物测定时，对浸出方法(冷浸法、热浸法)，浸出溶剂种类(水、乙醇、甲醇)，浸出溶剂浓度(30%，50%，70%)进行了考察，结果，使用本研究的浸出方法和溶剂测定时，浸出物含量最高。
综上，黑骨藤的显微鉴别特征清晰易见；
薄层色谱鉴别方法专属性强，薄层色谱斑点清晰，分离度较好，伪品无相应斑点；
增加水分、总灰分、浸出物检查后，质量标准更完善；
本研究可以为提高黑骨藤药材的质量控制标准提供科学依据。