王瑜 梁超 王宝爱 徐玉婷
(海口市中医医院,海南 海口 570216)
缺血性脑卒中的发病率和死亡率很高，危及人类健康，是全球性的公共卫生问题。根据美国心脏协会发布的统计数据，每年在美国大约有795 000例患者被诊断出患有新发或复发性脑卒中。平均而言，每40 s就有1例患者被诊断为脑卒中，每4 min就有1例患者死于该病。脑卒中的死亡率为60%，而缺血性脑卒中约占所有脑卒中病例的87%〔1〕。在老年人群体中，脑缺血卒中给患者造成的影响是巨大的。越来越多的证据表明，脑卒中发作可以触发中枢神经系统(CNS)和全身免疫系统内的炎症级联反应，这是缺血性脑卒中病理进展的关键因素〔2〕。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路在细胞增殖、炎症、分化和细胞凋亡过程中发挥着重要作用〔 3〕。
减少脑缺血性脑卒中的细胞凋亡和炎症反应对于缺血性脑卒中的改善和治疗可能至关重要。有研究表明PI3K/Akt信号通路的激活与缺血/再灌注损伤的保护有关〔4〕。白藜芦醇是一种在葡萄、浆果、花生和其他植物中发现的天然多酚，由于其在许多疾病中作为预防和治疗剂的潜在用途而受到广泛关注〔5〕。研究发现白藜芦醇可通过抑制神经炎症来调节血浆和肠黏膜细胞因子〔包括白细胞介素(IL)-10和IL-17A〕的水平对急性脑卒中发挥保护作用〔6〕。有研究表明，白藜芦醇可通过激活PI3K/Akt信号通路抑制骨关节炎相关炎症的发展〔7〕。本研究探讨白藜芦醇激活PI3K/Akt信号通路抑制血清中炎症因子IL-6和IL-1β的分子机制。
1.1实验细胞株和主要试剂 21月龄雄性SD大鼠均购买于上海医药工业研究院；
2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(1%，BP-DL511，南京森贝伽生物科技有限公司)；
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(C1088，碧云天)；
IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(ab178013)、IL-1β ELISA试剂盒(ab214025)、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗体、二抗山羊抗兔IgG均购自Abcam公司。
1.2缺血性脑卒中大鼠模型构建 36只大鼠饲养于无特殊病原体级层流架上，恒温(24～26)℃，恒湿(45%～55%)，饲料、饮用水均经高温消毒后使用，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。分组：Control组(正常大鼠)、大脑中动脉闭塞(MCAO)组、白藜芦醇〔25 mg/(kg·d)处理〕组各12只，线栓法建立MCAO模型：大鼠用2%戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉固定，自颈部行1 cm长切口，暴露左颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈总动脉近心端和颈外动脉远心端；
在颈总动脉上两线结间打一松结，将线栓从颈外动脉插入颈内动脉进而到达大脑中动脉 (深度约12.0 mm)，血管阻塞1 h后拔出线栓，缝合皮肤。Control组只进行手术操作，不插入线栓，作为对照。整个手术过程平均15 min完成，术后保持大鼠体温，自由饮水、进食。
1.3老年脑缺血卒中大鼠模型构建的评价 TTC染色评价脑梗死体积。缺血24、48 h后，用2%戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉后处死动物。快速取出脑组织，以1 mm的间隔进行冠状切片，用2%的TTC染色。梗死体积的计算方法是将所有截面的梗死面积相加，再乘以总厚度。每组取6只大鼠进行评估计算后取平均值。一般神经系统行为学评分。灌注后24、48 h，根据一般神经系统评分评估神经系统评分。在一般评分中，评估以下6项一般神经功能：头发状况(0～2分)，耳朵位置(0～2分)，眼睛状况(0～4分)，自发活动(0～4分)，姿势(0～4分)，癫痫行为(0～12分)，每组取6只大鼠进行评估计算后取平均值。统计以双盲方式进行，统计人员未参加建模，不知晓分组信息。
1.4ELISA 术后10 d冰上提取Control组大鼠脑组织和MCAO组大鼠梗死周围区的皮层脑组织，按1∶10比例加入预冷的匀浆缓冲液，冰上研磨为组织匀浆后离心取上清液。采用IL-6和IL-1β ELISA试剂盒对各组大鼠脑组织培养上清炎症因子进行检测，试剂盒均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司，按照说明书进行操作，用底物四甲基联苯胺(TMB)显色。酶标仪 (BioTek，USA) 测定450 nm波长下测定吸光光度度值，并计算炎症因子浓度。重复3次平行实验。
1.5TUNEL染色实验 取大鼠脑组织石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，3% H2O2溶液中室温浸泡10 min。磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min，加入50 μl 20 μg/ml的蛋白酶K (Sigma，USA)，室温20 min去除组织蛋白。PBS洗3次，5 min/次。加入柠檬酸盐，抗原修复30 min，PBS洗2次，5 min/次。加50 μl末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)酶反应液，37°C避光1 h，以不含TdT酶的反应液为阴性对照，PBS洗3次，5 min/次。滴加50 μl过氧化物酶标记的抗地高辛(anti-digoxigenin)，37℃避光反应30 min，PBS洗3次，5 min/次。二氨基联苯胺(DAB,ZSGB-BIO，China)显色10 min，PBS漂洗3次后，苏木素复染后在显微镜 (Nikon，Japan) 下观察并拍照。
1.6Western印迹检测 组织加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min，用二喹啉甲酸(BCA)定量试剂盒进行定量，定量之后加入10 μl上样缓冲液95℃煮10 min后即可上样跑胶，于100 V泳道进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；
电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜；
封闭液〔5%牛血清白蛋白(BSA)/TBST〕封闭60 min，加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗体，4℃过夜。一抗孵育完毕后，用1×TBST溶液室温下摇床摇动洗膜，5 min×3次，加辣根过氧化酶标记的二抗山羊抗兔IgG H&L(辣根过氧化酶)，室温下杂交120 min，TBST洗膜3次，每次20 min后用电化学发光(ECL)试剂盒进行发光反应，观察Western印迹，并进行图像分析，实验重复3次。
1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件进行方差分析、t检验。
2.1白藜芦醇降低脑缺血卒中脑梗死面积 TTC染色检测24 h和28 h脑组织结果显示，与Control组相比，MCAO组脑梗死面积显著增多，和MCAO组相比，白藜芦醇处理组脑梗死面积降低，说明白藜芦醇降低脑缺血脑卒中脑梗死面积。见图1。
2.2神经行为学评分检测 神经行为学评分结果显示，与Control组〔(1.33±0.52)分〕相比，MCAO组神经行为学评分〔(19.34±1.96)分〕明显升高(P<0.05)；
与MCAO组相比，白藜芦醇组神经行为学评分〔(14.33±1.02)分〕明显降低(P<0.05)，说明白藜芦醇降低脑缺血卒中神经病理机制。
2.3白藜芦醇降低老年缺血性脑卒中大鼠血清IL-6和IL-1β的表达水平 ELISA结果显示，与Control组相比，MCAO组血清IL-6和IL-1β表达水平明显升高(P<0.05)；
与MCAO组相比，白藜芦醇组血清IL-6和IL-1β表达水平明显降低(P<0.05)。见表1。
1～3：Control组、MCAO组、白藜芦醇组；
图3同
表1 各组血清IL-6和IL-1β表达水平及PI3K/Akt信号通路蛋白表达水平比较
2.4白藜芦醇降低老年缺血性脑卒中脑组织凋亡水平 与Control组相比，MCAO组脑组织凋亡水平明显升高(P<0.05)；
与MCAO组相比，白藜芦醇组脑组织凋亡水平明显降低(P<0.05)。见图2。
图2 各组脑组织凋亡水平(TUNEL染色，×400)
2.5白藜芦醇激活PI3K/Akt信号通路 Western印迹结果显示，与Control组相比，MCAO组脑组织PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt表达水平明显降低(P<0.05)；
与MCAO组相比，白藜芦醇组脑组织PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表达水平明显升高(P<0.05)。见表1、图3。
图3 Western印迹检测各组PI3K/Akt信号通路蛋白表达
脑卒中是全球第二大死亡原因，其特征是高发病率致残疾和死亡率。发生在大脑某些区域的脑血流量不足时，导致神经功能障碍，已被列为世界范围内最常见的死亡和死亡原因之一〔8〕。缺血性脑卒中严重威胁着人类的生命和健康，并给家庭造成了沉重的负担〔9〕。脑缺血后，活化的免疫细胞和相关的细胞因子不仅可以加重缺血性脑损伤，还可以促进组织修复。鉴于中枢神经系统自身修复的能力有限，继发免疫反应的调节可有效改善缺血性脑卒中。Wytrykowska等〔10〕研究表明，与对照组相比，缺血性脑卒中患者血清中有较高的IL-1β和IL-6水平。
白藜芦醇被归类为植物雌激素，其结构类似于雌二醇，并且通过与雌激素受体a和b结合而发挥作用〔11〕。白藜芦醇已被证明可以减少脑卒中前和(或)后的脑损伤和神经系统损伤〔12〕，这些神经保护作用与该药的抗氧化、抗感染和抗凋亡特性有关。此外，白藜芦醇与雌激素受体的结合已经与其对缺血性脑的保护作用联系在一起。Lara等〔13〕研究表明，白藜芦醇和丙戊酸的结合可以显著减少了梗死体积及神经功能缺损。Yu等〔14〕研究表明，白藜芦醇预处理可显著改善脑卒中后体内和体外的神经功能，减少梗死体积，增强活力并减少神经元的凋亡。Koronowski等〔15〕研究表明，白藜芦醇可以通过神经元调节脑糖酵解功能中的新作用，构成缺血耐受的强大神经保护机制及Ⅲ类去乙酰化酶(SIRT)1在脑中介导的代谢适应。
PI3K/Akt信号传导途径是重要的存活和抗凋亡信号传导途径，在细胞凋亡、存活、增殖、细胞骨架变化及其他活动中起着重要的生物学功能〔16〕。Peng等〔17〕研究表明，在缺血性脑卒中，miR-221在患者中被下调，并通过调节磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)/PI3K/Akt途径促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的功能，木犀草素可以通过抑制基质金属蛋白酶(MMP)9和激活PI3K/Akt信号通路具有治疗缺血性脑卒中的潜力〔18〕。Fan等〔19〕发现缺血性脑卒中是世界上严重残疾的主要原因，与感觉运动和认知功能障碍的高发有关，S-奥拉西坦(ORC)可以减少TUNEL阳性细胞，增加细胞活力，降低血清乳酸脱氢酶(LDH)活性，通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路抑制细胞凋亡率。二氢辣椒素(DHC)通过PI3K/Akt调节大鼠缺血性脑卒中后增强亚低温诱导的神经保护作用〔20〕。趋化因子蛋白(CXCL)8的功能性抑制通过调节缺血性脑卒中小鼠的PI3K/Akt/核转录因子(NF)-κB信号传导途径来促进神经胶质细胞活化并抑制神经炎症〔21〕。本研究结果发现，白藜芦醇能使脑梗死面积降低，神经行为学评分降低，大鼠血清IL-6和IL-1β降低，脑组织凋亡水平降低及脑组织PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表达水平升高。白藜芦醇通过激活PI3K/Akt信号通路调控老年缺血性脑卒中大鼠血清IL-6、IL-1β含量的分子机制，为老年缺血性脑卒中的治疗提供了新的研究思路。
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