李莹 林建东 林晓 肖文彪 郭清清 林炳文 廖秀玉
(福建医科大学附属第一医院重症医学科，福建 福州 350005)
脓毒症属于一种可累及多个器官、系统的因感染所致的全身性炎症反应综合征，急性肾损伤是脓毒症进展过程中最为严重的一种并发症，急性肾损伤的发生在一定程度上威胁着患者的生命安全，并发此并发症的患者预后生存期均较短〔1,2〕。目前临床研究认为脓毒症并发急性肾损伤的发生与多种因素相关，微小RNA(miRNA)在该病发生过程中具有重要的作用，miR-10a属于miRNA家族成员之一，其被证实与脓毒症并发急性肾损伤相关〔3〕。本文分析下调微小RNA-10a(miR-10a)对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的影响。
1.1材料 研究动物：选取60只SFP级雄性大鼠，购自慕恩(广州)生物科技有限公司，动物许可证号：SYXK(粤)2020-0225，6～8周龄，平均体重(252.16±25.26)g，在相对湿度为30%～35%、温度为(23.8±1.5)℃下饲养1 w，每日光照24 h，明暗周期为12 h。本试验操作均严格参照动物实验伦理要求相关规定进行，且获得医院伦理委员会审批同意。主要试剂：miR-10a慢病毒载体构建由上海吉玛公司设计并完成，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒及相关试剂均由美国RD公司提供，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒及相关试剂均由美国Cayman公司提供，小鼠抗大鼠ERK抗体由深圳市豪地华拓生物科技有限公司提供，兔抗人p-ERK抗体由上海冠导生物工程有限公司提供，兔抗大鼠MEK抗体由北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)提供，小鼠抗大鼠p-MEK抗体由上海梵态生物科技有限公司提供。
1.2分组及建模 随机选取60只SPF级雄性大鼠，其中15只为空白组，其余45只采用经典的盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肾损伤大鼠模型，对大鼠行常规20 mg/kg的2%戊巴比妥腹腔麻醉后，以腹部正中为操作切口，制备大约1 cm的切口，将腹膜逐层打开，找到盲肠后对其远端行游离处理，将盲肠中的粪便挤向远端，盲肠中段使用3号丝线结扎，盲肠远端使用12号针头做穿孔处理，将少量粪便挤压至盲肠表面，之后回纳盲肠、缝合腹膜、关闭腹腔，术后大鼠进行单笼饲养。建模后大鼠表现为直肠温度较建模前升高>1℃、呼吸频率、心率为建模前的2倍，精神萎靡、竖毛、口鼻分泌物增多及少动等表现为建模成功标准，最终45只大鼠均建模成功，随机分为模型组、上调组、下调组各15只。
1.3miR-10a慢病毒载体构建及滴定 使用GenBank查找序列获得miR-10a序列，构建miR-10a过表达转染质粒(上调)、miR-10a沉默转染质粒(下调)，由上海吉玛公司设计并合成，并做慢病毒滴度测定(病毒滴度为1×109TU/ml)。在建模后上调组尾部注射含10 μl miR-10a过表达慢病毒悬液，下调组尾部注射10 μl miR-10a沉默慢病毒悬液。空白组、模型组不进行任何处理，24 h后观察大鼠变化。
1.4miR-10a转染效率鉴定 在miR-10a转染完成24h后，采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-10a转染效率，随机选取每组5只大鼠，使用5%苯巴比妥做常规腹腔注射麻醉后处死，迅速取肾组织，提取肾组织RNA，逆转录获得cDNA。以U6为内参照，miR-10a上游序列5′-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下游：5′-GATTGGAT GTTCTCCACAGTCTC-3′；
U6上游序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′。
1.5样本采集 采集各组剩余10只大鼠尾部静脉血1.5 ml，分离血清备用。静脉血采集完成后做实验动物常规麻醉后迅速取肾组织，分为3等份，其中1份做组织切片，另外2份在液氮中保存用于后续指标检测。
1.6肾功能、肾损伤、局部炎症反应相关指标测定 采用ELISA测定肾功能指标肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肾损伤分子(KIM)-1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、局部炎症反应相关指标肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10水平，取所制备的血清，将ELISA检测试剂盒放置于室温下做平衡20 min处理，之后将不同浓度的50 μl标准品加入至标准孔中，将50 μl待测样品加入至样本孔中，每孔中加入100 μl的辣根过氧化物酶标记的检测抗体，密封反应孔，在温度为37℃的环境下孵育1 h，将上清液弃除后加入350 μl的洗涤液，在室温环境下孵育1 min，弃除上清液，重复上述步骤5次，之后将50 μl的底物A、底物B加入至每孔中，37℃孵育15 min，之后终止反应，获得Cr、BUN、NGAL、KIM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。
1.7病理组织学观察 取肾组织切片，脱蜡、脱水后行苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察肾组织病理变化。
1.8肾脏氧化应激指标检测 取1份液氮中所保存的肾组织，制备为组织匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定氧化应激指标SOD活性，采用改良硫代巴比妥酸法测定氧化应激指标MDA水平。
1.9肾组织ERK信号通路蛋白检测 采用Western印迹测定肾组织ERK信号通路蛋白表达量，取1份液氮中保存的肾组织，提取组织总蛋白，取20 μg蛋白质样本，电泳1.5 h后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在室温下做封闭处理，之后分别加入1∶1 000 TBST给予稀释的ERK信号通路蛋白ERK、p-ERK、丝裂原活化蛋白(MEK)、p-MEK一抗，使用1∶2 500的辣根过氧化氢酶标记的二抗在室温下孵育处理，电化学发光(ECL)显色，使用Labwork凝胶图像扫描所获得胶片，以GAPDH为内参，计算ERK、p-ERK、MEK、p-MEK蛋白表达量。
1.10统计学处理 采用SPSS25.0软件，计量资料经Levene法检测具备方差齐性，Shapiro-wilk检验符合正态分布，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用独立样本t检验。
2.1转染效率鉴定 与空白组(1.14±0.35)相比，模型组、上调组、下调组miR-10a表达量(2.46±0.84、3.25±1.02、1.99±0.32)明显升高(P<0.05)；
与模型组相比，上调组miR-10a表达量升高，下调组miR-10a表达量降低，有统计学差异(P<0.05)，说明miR-10a转染成功。
2.2各组肾功能、肾损伤相关指标对比 与空白组相比，模型组、上调组、下调组各指标水平明显升高(P<0.05)；
与模型组相比，上调组各指标水平明显升高，下调组各指标水平明显降低(P<0.05)；
与上调组相比，下调组各指标水平明显降低(P<0.05)。见表1。
2.3各组局部炎症反应指标对比 与空白组相比，模型组、上调组、下调组各指标水平明显升高(P<0.05)；
与模型组相比，上调组各指标水平明显升高，下调组各指标水平明显降低(P<0.05)；
与上调组相比，下调组各指标水平明显降低(P<0.05)。见表1。
2.4各组肾脏组织学观察 空白组肾组织结构正常，无病变；
模型组肾组织可见有细胞水肿、炎性浸润、肾小管闭塞、肾小球皱缩表现；
上调组肾组织可见有较模型组更为严重的细胞水肿、大量的炎性浸润、肾小管闭塞、肾小球皱缩表现；
下调组肾组织可见细胞水肿、炎性浸润现象改善，肾小管、肾小球病变缓解。见图1。
2.5各组肾脏氧化应激程度对比 与空白组相比，模型组、上调组、下调组SOD活性明显降低，MDA水平明显升高(P<0.05)；
与模型组相比，上调组SOD活性明显降低，MDA水平明显升高，下调组SOD活性明显升高，MDA水平明显降低(P<0.05)；
与上调组相比，下调组SOD活性明显升高，MDA水平明显降低(P<0.05)。见表2。
2.6各组肾组织ERK信号通路蛋白表达对比 与空白组相比，模型组、上调组、下调组各蛋白表达明显升高(P<0.05)；
与模型组相比，上调组各蛋白表达明显升高，下调组各蛋白表达明显降低(P<0.05)；
与上调组相比，下调组各蛋白表达量明显降低(P<0.05)。见表2、图2。
表1 各组肾功能、肾损伤及局部炎症反应指标对比
图1 各组肾脏组织学观察(HE染色，×200)
表2 各组肾脏氧化应激程度及肾组织ERK信号通路蛋白表达对比
图2 各组肾组织ERK信号通路蛋白表达
在脓毒症发生发展过程中机体存在不同程度的炎症反应，随着疾病的不断进展，可导致多个器官出现急性功能性损伤，急性肾损伤在脓毒症中较为常见，其可导致机体内环境紊乱，加重或者诱发其他器官损伤，严重威胁着患者的生命安全〔4～6〕。
目前临床上随着对脓毒症并发急性肾损伤的不断深入研究发现，该病的发生受多种因素的共同影响，微小RNA(miRNA)属于一类长度大约为22个核苷酸的内源性非编码单链RNA，其参与多种生理病理过程〔7～9〕。miR-10a属于miRNA家族成员之一，其定位于7号染色体上，研究发现，miR-10a参与多种恶性疾病的发生，miR-10a参与脓毒症的免疫应答和局部炎症反应，当炎症诱发肾脏损伤后可经基因调控作用和介导促进炎症细胞因子表达参与炎症损伤，表现为其表达异常升高〔10～12〕。陈隆望等〔13〕研究认为，经调控miR-10a的表达可改善脓毒症小鼠脾脏CD4+CD25+Treg免疫功能。本研究结果显示，经下调miR-10a后，脓毒症并发急性肾损伤大鼠的肾脏损伤明显被修复，表现为肾脏局部炎症、氧化应激被抑制，分析其原因可能与miR-10a被抑制后其所诱发的局部炎症反应和氧化应激被抑制而发挥抑制肾脏进一步损伤，促进肾功能恢复相关。
ERK属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一个亚组，其在临床上被证实可受多种细胞因子和生长因子的激活〔14,15〕。ERK信号通路可介导局部炎症反应，可被氧化应激、细胞因子等所激活，促使炎性细胞因子过量表达，诱发组织损伤〔16,17〕。研究显示，ERK信号通路参与肾脏损伤过程，如在糖尿病肾病中其被激活，可介导肾小球系膜细胞增生肥大，进一步加剧肾脏损伤〔18,19〕。另外有报道称，在肾脏调控和损伤过程中，肾脏可经调控某些miRNA的表达对一些关键的信号通路发挥作用，参与细胞增殖、凋亡，最终介导肾脏损伤〔20,21〕。本研究进一步分析下调miR-10a修复脓毒症并发急性肾损伤大鼠的肾脏损伤的作用机制，提示下调miR-10a可能经促进ERK信号通路失活发挥肾脏损伤修复作用。但目前临床研究并未有报道称miR-10a、ERK信号通路与脓毒症并发急性肾损伤的关系，因此本文上述研究结果还需后续研究进一步分析证实。
综上，下调miR-10a可明显抑制脓毒症并发急性肾损伤肾脏氧化应激程度，抑制局部炎症，修复肾损伤，其作用机制可能与促使ERK信号通路失活相关。
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