张容华，杨放，郑艾妮，鲍颖霞，赖烨才，余华，陈绮玲，王健松*（1.广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂，广州 510515；
2.广东省化学药原料与制剂关键技术研究重点实验室，广州 510515；
.澳门大学中华医药研究院，中药质量研究国家重点实验室，澳门 999078）
阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD）是一种慢性进行性神经退行性疾病，以记忆和认知能力的进行性减退为主要临床特征[1]。据统计，全球AD 患者已超过5000 万人，预计2050年将突破1.52 亿人[2-3]。我国已经进入老龄化社会，预计到2050年，我国AD 患病人数超过3000 万，是新发病例全球增速最快的国家之一[4-5]。而现有药物主要是改善或延缓症状，对初期和中期患者起治疗作用，维持患者认知状态[6-10]。LW33 是由我公司与中山大学联合开发的磷酸二酯酶9A（PDE9A）抑制剂，为一类创新药，其结构式见图1。磷酸二酯酶（PDE）抑制剂能够有效抑制PDE 对于环磷酸腺苷（cAMP）和/或环磷酸鸟苷（cGMP）的降解，使得人体与认知相关的生理功能得以正常表达，因此PDE 抑制剂可用于治疗学习记忆障碍等中枢神经系统疾病[11-16]。LW33 具有良好的类药性、成药性特征和药动学性质，是高效价、多靶点抗AD 的候选药物[17]。
图1 LW33 化学结构式Fig 1 Chemical structure formula of LW33
LW33 作为一个非常有潜力的候选药物，其有关物质检测方法在国内外均未有报道，本文建立了检测LW33有关物质的HPLC 法和UPLC 法，两种方法学经验证均符合要求，且UPLC 法分析快速，节省溶剂，适用于快速检测LW33 中的有关物质，提高研发的效率。
Waters Acquity UPLC 液相色谱仪（包括Quaternary Solvent Manager 四元溶剂管理器，Sample Manager-FIN 样品管理器，二极管阵列检测器PDA，美国Waters 公司）；
Waters Alliance e2695液相色谱仪（包括Separations Module，2998 二极管阵列检测器PDA，美国Waters 公司）；
Milli-Q超纯水系统（美国Millipore 公司）；
P30H 超声波清洗器（德国Elma 公司）。
对照品LW33（批号：ZS1904001，含量：97.55%，自制标定），杂质A 对照品（批号：ZS1904001，含量：96.41%，自制标定），杂质B 对照品（批号：ZS1904001，含量：98.75%，自制标定）。甲醇（色谱纯，德国Merck 公司），冰醋酸（分析纯，广州化学试剂厂），超纯水（Milli-Q 制备）。3 批LW33 原料供试品（批号：ZS1904001、ZS1904002、ZS1904003，广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂）。
2.1 色谱条件
2.1.1 色谱条件（UPLC） 色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）；
流速为0.21 mL·min－1；
进样量1 µL；
柱温25℃；
检测波长为 257 nm；
流动相系统为水溶液（用冰醋酸调pH 值至3.0）（A）-甲醇（B）；
梯度洗脱程序如下：0～12 min，70%～90%B；
12～14 min，90%～70%B；
14～16 min，70%B。
2.1.2 色谱条件（HPLC） 色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；
流速为1.0 mL·min－1；
进样量10 µL；
柱温25℃；
检测波长为 257 nm；
流动相系统为水溶液（用冰醋酸调pH 值至3.0）（A）-甲醇（B）；
梯度洗脱程序如下：0～30 min，70%～90%B；
30～35 min，
90%～70%B；
35～40 min，70%B。
2.2 溶液的制备
2.2.1 溶剂的制备 取流动相A 与流动相B 按比例30∶70（v/v）混合制成。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取LW33和杂质B 适量，置于同一量瓶中，加溶剂超声溶解，放冷，并稀释制成质量浓度分别为约75、35 μg·mL－1的混合对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，加溶剂超声溶解，放冷，并稀释制成质量浓度为1 mg·mL－1的溶液。
2.2.4 自身对照溶液的制备 精密量取供试品溶液0.5 mL，置50 mL 量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
2.2.5 系统适用性溶液的制备 精密称取LW33对照品、杂质A 对照品和杂质B 对照品适量，加溶剂超声溶解，放冷，并稀释制成质量浓度分别为约1、0.01、0.01 mg·mL－1的溶液。
2.3 专属性试验
按“2.1.1”项下的色谱条件（UPLC）和“2.1.2”项下的色谱条件（HPLC），分别取空白溶剂、供试品溶液进行检测，记录色谱图，色谱图见图2。结果表明，空白溶剂均无干扰。
图2 专属性色谱图Fig 2 Chromatograms of specificity
2.4 系统适用性试验
取“2.2.5”项下系统适用性溶液，分别在“2.1.1”项的色谱条件（UPLC）和“2.1.2”项的色谱条件（HPLC）下进样分析，记录色谱图，色谱图见图3。结果表明，在UPLC 和HPLC 系统下，主成分峰与相邻杂质A 峰的分离度分别为2.5 和3.0，系统适用性均符合要求。
图3 系统适用性色谱图Fig 3 Chromatograms of system applicability
2.5 强制降解试验
取LW33 分别用2 mol·L－1盐酸溶液、2 mol·L－1氢氧化钠溶液、30%过氧化氢溶液、高温60 ℃、高湿92.5%等进行降解试验。按“2.1.1”项下的色谱条件（UPLC）和“2.1.2”项下的色谱条件（HPLC），进行检测，记录色谱图。结果表明，在所有强制降解条件下，空白溶剂均不影响杂质检测，降解产物与主峰的分离度均符合要求，主峰纯度角均小于纯度阈值，各强制降解条件前后的物料平衡在90%～110%，均符合要求。两种方法测得的杂质谱相似，降解试验色谱图见图4、5。
图4 强制降解试验UPLC 色谱图Fig 4 UPLC chromatograms of forced degradation test
2.6 标准曲线、定量限和检测限
精密量取“2.2.2”项下的混合对照品溶液，用溶剂稀释为一系列质量浓度的对照品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件（UPLC）和“2.1.2”项下的色谱条件（HPLC）检测，以化合物的峰面积为纵坐标，相对应的化合物质量浓度为横坐标，建立标准曲线，得回归方程，结果见表1。试验结果显示，LW33 在1.568～31.36 µg·mL－1与峰面积线性关系良好；
杂质B 在0.7094～14.19µg·mL－1与峰面积线性关系良好。在UPLC 系统和HPLC 系统下，线性关系均符合要求。
另取混合对照品溶液稀释，分别进样分析，取信噪比值为10（S/N＝10）的质量浓度为定量限（LOQs），S/N＝3 的质量浓度为检测限（LODs）。结果见表1，灵敏度均符合要求。
表1 LW33 和杂质B 的回归方程、定量限和检测限Tab 1 Regression equation，LOQs and LODs of LW33 and impurity B
2.7 重复性
按“2.2.3”和“2.2.4”项下方法平行制备6 份供试品溶液及自身对照溶液，分别在 “2.1.1”项下的色谱条件（UPLC）和“2.1.2”项下的色谱条件（HPLC）下进样分析，以杂质含量的RSD考察。结果表明，在UPLC 系统下，杂质B 含量的RSD为12%，其他最大单个杂质含量的RSD为0.0%，总杂质量的RSD为3.8%；
在HPLC 系统下，杂质B 含量的RSD为0.0%，其他最大单个杂质含量的RSD均为2.6%，总杂质量的RSD为1.8%。在UPLC 系统和HPLC 系统下，6 份供试品杂质含量的RSD均不大于15%，重复性符合要求。
2.8 中间精密度
取“2.7”重复性项下供试品溶液及自身对照溶液，分别在“2.1.1”项的色谱条件（UPLC）和“2.1.2”项的色谱条件（HPLC）下进行样品检测，记录色谱图。结果表明，在UPLC 系统下，杂质B 含量的RSD为12%，其他最大单个杂质含量的RSD为0.0%，总杂质量的RSD为3.8%；
在HPLC系统下，杂质B 含量的RSD为0.0%，其他最大单个杂质含量的RSD为2.6%，总杂质量的RSD为1.8%。12 个杂质含量数据中，杂质B 含量的RSD为9.5%，其他最大单个杂质含量的RSD为10%，总杂质量的RSD为12%，12 个杂质含量数据的RSD均不大于20%，精密度符合要求。
2.9 准确度
称取LW33 共9 份，置于25 mL 量瓶中，分别加入已知量的杂质B 对照品溶液，相当于杂质限度的15%、100%、200%水平的溶液。分别精密量取空白溶剂、本底溶液、上述各加标供试品溶液及自身对照溶液，在“2.1.1”项的色谱条件（UPLC）和“2.1.2”项的色谱条件（HPLC）下进样分析，记录色谱图，考察平均回收率和RSD。结果表明，在UPLC 系统下，杂质B 低、中、高质量浓度的平均回收率分别为107.6%、104.1%、103.0%，RSD分别为2.1%、1.5%、1.9%；
在HPLC 系统下，杂质B 低、中、高质量浓度的平均回收率分别为101.7%、101.8%、99.3%，RSD分别为0.78%、0.27%、0.87%。在UPLC 系统和HPLC 系统下，准确度符合要求。
2.10 稳定性
图5 强制降解试验HPLC 色谱图Fig 5 HPLC chromatograms of forced degradation test
取“2.7”项下供试品溶液及自身对照溶液在室温下放置24 h，按“2.1.1”项下的色谱条件（UPLC），分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析。结果表明供试品溶液在24 h 内稳定。
2.11 样品的检测
取3 批样品（批号：ZS1904001，ZS1904002，ZS1904003）按“2.2.3”项下的方法平行制备供试品溶液，在“2.1.1”项的色谱条件（UPLC）和“2.1.2”项的色谱条件（HPLC）下进样分析，记录化合物峰面积。有关物质的结果见表2。
表2 样品检测结果(%)Tab 2 Sample detection (%)
3.1 色谱条件的优化
本试验首先优化了流动相系统。在纯水-甲醇流动相系统中，色谱峰峰形不够理想。因此在水相中加入冰醋酸，结果显示，峰形和分离度均有较好的改善。其次筛选适用HPLC 系统的色谱柱，分别采用了Luna C18（2）100A（4.6 mm×250mm，5 µm）和SHISEIDO CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）色谱柱进行试验，系统适用性溶液的进样结果显示，Luna C18 色谱柱未达基线分离的要求，而SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱则能达到基线分离的要求。之后进行波长优化，采用PDA 检测器得到LW33 和杂质A、B的紫外吸收图，试验结果显示最大或较大吸收波长分布在216～220 nm 以及256～271 nm。因甲醇截止波长为210 nm，综合考虑为使LW33 和各杂质均处于较大吸收范围，同时避免溶剂末端吸收效应，故选用主成分最大吸收波长257 nm 作为检测波长。最后进行供试品溶剂的筛选，为避免溶剂效应，供试品溶剂选择水（用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（30∶70）。
3.2 方法的对比
本研究中UPLC 和HPLC 两种方法的准确度、精密度、线性等方法学验证结果基本一致，杂质谱相似，可以互相替代。由系统适用性色谱图可见，杂质A 紧邻主峰，在HPLC 色谱图中，杂质A 位于主峰后；
在UPLC 色谱图中，杂质A 位于主峰前。分析出峰顺序变化的原因：杂质A 的极性与主成分的极性较为接近，两者与固定相之间作用力的少许差别会影响它们在色谱柱上的保留。尽管本研究中HPLC 与UPLC 两种色谱柱的填料类型均为十八烷基硅烷键合硅胶，但是为不同的品牌。通常，不同品牌甚至同一品牌的不同系列色谱柱，会采用不同的硅胶基质、键合技术和封端技术，其疏水作用、空间位阻、氢键作用、静电作用等能力的差异，使各色谱柱表现出不一样的选择性[18]。
HPLC 具有普遍适用性，但分析时间长，且与质谱联用时需分流。与之相比，UPLC 具有分析时间短，溶剂需要量较少，分离度好，灵敏度高，质谱接口良好的优点；
但同时在分析应用上仍存在仪器相对贵，样品前处理要求严格，峰面积重现性相对稍差，市场所供应的不同分离机制的小颗粒填料的色谱柱较少等缺点[19]。
在一类新药LW33 研发的过程中，我们先开发的是普通的HPLC 法，符合方法学验证要求，在实际应用中，该方法不仅要用于最终成品的有关物质的检测，还用于合成工艺中的中间体控制、工艺优化中的杂质对比等过程，工作量较大，为了提高检测的及时性和研发效率，进一步开发了UPLC 法，在以上UPLC 具备的众多优点中，分析时间是首要考虑的因素。与HPLC 法相比，UPLC 法缩短了一半以上的运行时间，溶剂使用量仅为HPLC 法的1/10，提高了效率，节省溶剂；
且UPLC 可直接与质谱联用，无需分流，为杂质的后续研究提供极大方便[20]。