赵钧锋，李翔宇，王 迅
（大连市第三人民医院神经介入中心，辽宁 大连 116033）
胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常见的侵袭性脑肿瘤，预后极差，也被世界卫生组织归类为星形细胞系的Ⅳ级胶质瘤。目前标准的治疗方案包括手术、替莫唑胺（TMZ）化疗及与放疗联合治疗等，但治疗效果不甚理想[1]。研究表明，GBM患者初诊后的中位生存期仅为15～18个月，预后不良与GBM细胞的致瘤属性和胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）有关[2]。GSCs具有自我更新和多重分化能力，对化疗和放疗具有耐药性。因此，它们可能是GBM治疗失败和高复发率的原因。研究表明GSCs 能够促进GBM的发生、发展，且与GBM的上皮间质转化（EMT）、迁移侵袭、放化疗耐受性及复发紧密相关[3]。而EMT的活化进程与肿瘤干细胞的干性激活及活性调节方面又具有紧密的联系。
类固醇受体辅助活化因子-1（SRC-1）是一种重要的核受体转录活性调节因子，是SRC家族中在脑组织中分布最多的成员[4]。SRC-1可参与调节多种机体的正常生理功能，而且SRC-1可作为核受体共活化因子或独立的因子促进多种癌症的发生发展[5]，但SRC-1在GBM中的作用及机制尚未明确。本研究的前期研究首次发现：SRC-1表达与胶质瘤恶性等级呈正相关；
而且在GBM细胞中敲低或过表达SRC-1后，发现SRC-1可促进细胞增殖、迁移，降低对放化疗的敏感性，增加细胞自我更新能力。故本研究将在细胞模型中进一步明确SRC-1在GBM中的表达，并统计分析SRC-1表达与EMT、肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭的相关性，为寻找潜在的治疗靶点及建立新的有效的治疗方案提供理论依据。
1.1 研究对象选取人脑胶质细胞株LN229、U251、U87-MG、T98G、U118和SVG-p12作为本研究细胞模型。所有细胞在添加10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基中进行培养，保湿环境温度37 ℃，在含5% CO2大气中。
1.2 研究方法①构建SRC-1敲低的细胞株。利用shRNA干扰技术，将SRC-1-shRNA、control-shRNA及Luciferase cDNA构建至PLKO.1慢病毒载体，得到PLKO.1-S RC-1-shRNA-luc及PLKO.1-control-shRNA-luc质粒；
在293T细胞中进行病毒包装及富集，将收集的病毒上清感染U251细胞，通过实时聚合酶链反应（Realtime PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测SRC-1表达情况，得到SRC-1敲低的U251-SRC-1-luc shRNA及U251-control-luc shRNA细胞。②构建SRC-1过表达的细胞株。利用cDNA转染技术，以pENTER-NCOA1（SRC-1）（购自吉凯基因）质粒为模板，PCR扩增合成SRC-1 cDNA。将SRC-1 cDNA及Luciferase cDNA构建至pCDH-CMV-MCS1-EF1-Puro病毒载体，得到pCDHSRC1-luc质粒；
病毒上清分别感染SVG p12和LN229细胞，Real-time PCR及Western blot检测SRC-1表达情况，最终获得SVG p12-SRC-1-luc、SVG p12-control-luc及LN229-SRC-1-luc、LN229-control-luc。
1.3 观察指标①免疫染色、Real-time PCR和Western blot法检测各细胞中SRC-1表达情况。②提取细胞的RNA和蛋白，分别采用Real-time PCR和Western blot检测各细胞中钙黏蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Twist相关蛋白1（Twist1）等EMT相关基因的表达，分析表达差异。③选取TMZ和索拉菲尼（SOR）两种胶质母细胞瘤临床用药联合SRC-1敲低进行四唑盐（MTT）比色法实验，48 h检测增殖能力，观察SRC-1敲低对胶质瘤母细胞化学治疗敏感性的影响。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件处理数据。计量资料以()表示，两组间比较采用独立样本t检验，3组及以上数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；
计数资料以[例(%)]表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 SRC-1和Twist1在细胞模型中表达情况采用RTPCR方法检测各细胞株及对照细胞中SRC-1 mRNA的表达。SRC-1在肿瘤与正常细胞比较时log2转化mRNA表达倍数的变化见图1A。SRC-1的平均mRNA表达log2 (T/N)比为0.58。SRC-1细胞中明显上调。Western blot进一步验证了SRC-1的上调，见图1B。SRC-1蛋白在肿瘤细胞中明显过表达。此外，肿瘤细胞中SRC-1的免疫组化染色显示，SRC-1也有高表达，见图1C。在数种细胞系中检测了SRC-1的蛋白表达，发现SRC-1在U251和U87MG中高表达，在T98MG、LN229及SVG p12中低表达，见图1D。
图1 SRC-1和Twist1在细胞模型中表达情况
2.2 SRC-1的表达对胶质细胞迁移、侵袭和肿瘤移植生长的影响为了确定SRC-1在GBM的作用，本研究使用慢病毒的shRNA表达系统抑制细胞系中SRC-1的表达，SRC-1蛋白表达被sh-SRC-1显著下调（t=38.347，P＜0.05）；
下调SRC-1抑制了Twist1蛋白的表达（P＜0.05）。此外，敲低SRC-1可增加E-cadherin的表达（t=33.881，P＜0.05），抑制Vimentin的表达（t=34.119，P＜0.05），见图2。
图2 SRC-1的表达对胶质细胞迁移、侵袭和肿瘤移植生长的影响
2.3 SRC-1敲低对胶质瘤母细胞化学治疗敏感性的影响选取TMZ和SOR两种胶质母细胞瘤临床用药联合SRC-1敲低进行四唑盐(MTT)比色法实验，48 h检测增殖能力，见图3。与独加药组比较，SRC-1敲低后在500 μmol/L和1 000 μmol/L浓度的TMZ时都能更好地抑制U251细胞增殖（t=18.945，P＜0.05；
t=26.127，P＜0.05），50 μmol/L和80 μmol/L浓度的SOR得出相似的结果（t=21.335，P＜0.05；
t=24.882，P＜0.05），表明敲低SRC-1能增强胶质母细胞瘤细胞对临床药物TMZ和SOR的敏感性。
图3 SRC-1敲低对胶质瘤母细胞化学治疗敏感性的影响
GBM是恶性程度最高的脑胶质瘤（WHO，Ⅳ级，2007），确诊后5年生存率小于5%[6]。GBM的重要生物学特征是侵袭性生长，易复发和肿瘤组织内部细胞异质性。目前临床上仍以手术结合放化疗为主要治疗方法，因其增长迅速、高度侵袭性及放化疗多耐性等特点，预后极差，中位生存期仅15个月[7]。
EMT是上皮细胞失去极性与上皮样组织，转化成间叶细胞表型的过程。而在此进程中上皮细胞可以转化成间质细胞，并再次转化为上皮细胞，这是肿瘤干细胞可塑性的主要表现，发生EMT的肿瘤细胞具有干样的特征[8]。EMT的活化与肿瘤干细胞的干性激活及活性调节方面具有紧密的联系。因此，EMT是癌症进展的关键，其特点是肿瘤细胞中E-cadherin表达减少，Vimentin表达增加[9]。
SRC-1可参与调节多种机体的正常生理功能，如脑的发育与成熟、血管生成、机体代谢及生殖等。SRC-1在多种病理过程中也起重要作用，如肥胖、糖尿病、血脂异常、癌症等[10]。课题组前期采用组织芯片及免疫组织化学的方法检测发现：SRC-1的表达与人胶质瘤分级呈正相关，在GBM中表达最高；
而且通过稳定敲低SRC-1可导致GBM细胞自我更新能力、干性相关基因蛋白的表达下降，而过表达SRC-1则增强GBM的干性表达。由此提示SRC-1与GBM的发生发展及激活GSCs方面发挥重要作用。既往研究证实在乳腺癌中，SRC-1可间接抑制E-cadherin的表达[11]。本研究中发现SRC-1在胶质瘤中高表达，且与恶性分级呈正相关，在人GBM细胞U251和LN229中，分别敲低和过表达SRC-1研究其在GBM中的作用发现：SRC-1可促进肿瘤细胞的增殖；
增强细胞迁移与侵袭能力，抑制胶质母细胞瘤细胞系中E- cadherin的表达，增加Vimentin的表达。因此，推测SRC-1通过诱导EMT促进胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭。
TMZ和SOR作为目前临床上用于治疗GBM的主要化疗药物，对GSCs的敏感性低于GBM肿瘤细胞，这与DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）的表达增加有关[12]。此外，其他化疗药物，如卡铂、紫杉醇和依托泊苷等，对GSCs的敏感性也下降[13]。本研究结果显示SRC-1的下调显著增强胶质母细胞瘤细胞对临床药物TMZ和SOR的敏感性，也与SRC-1可导致GBM细胞自我更新能力和干性相关基因蛋白的表达下降有关[14]。
综上所述，SRC-1在体外可促进胶质母细胞瘤细胞的非锚定生长、细胞迁移和侵袭，与诱导EMT过程有关。SRC-1是胶质母细胞瘤患者潜在的预后生物学标记物和治疗靶点。
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