庞瑞洋，周 力，吕家迪
中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 免疫学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005
造血干细胞移植在临床上最初用于治疗严重的造血缺陷疾病以及肿瘤患者放化疗后的造血系统重建，目前也是许多自身免疫性疾病和恶性肿瘤的过继免疫治疗手段之一[1]。移植的造血干细胞可以来源于骨髓、脐带血或外周血，其中骨髓的造血干细胞最为丰富，小鼠骨髓移植实验也成为了探究造血干细胞分化发育和移植物抗宿主病的重要研究模型[2]。在小鼠骨髓移植前，需要采用全身辐照(total body irradiation，TBI)清除受体小鼠原有的骨髓细胞及免疫细胞，而全身辐照不仅对受到辐照的小鼠自身细胞造成损伤，非辐照的移植供体细胞也会受到损害，称为辐射诱导的旁观者效应(radiation-induced bystander effect，RIBE)，严重影响了植入供体细胞的生存和功能以及小鼠骨髓移植效果[3]。
RIBE主要是通过受辐照宿主中产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)对移植的造血干细胞造成损伤，可以通过调节ROS的解毒来恢复HSC的再生潜力[4]。芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)是一类能够感受外界环境中的刺激，并介导胞内转录调控的因子，在多种免疫和炎性反应疾病中发挥重要作用[5]。有多项研究表明AHR与氧化应激反应具有密切联系，激活的AHR通过诱导细胞色素P450 1A1(CYP1A1)的表达刺激ROS的产生，造成DNA损伤与细胞凋亡[6]。而CH223191是一种强效特异性的AHR拮抗剂，能够抑制AHR的核转位以及AHR与DNA的结合，减少依赖于AHR激活所诱导的ROS生成[7]。
因此，本研究旨在证明小鼠骨髓移植过程中RIBE对供体骨髓细胞和骨髓移植效果的影响，初步探究使用AHR抑制剂CH223191能否实现对供体骨髓细胞的保护，为小鼠骨髓移植模型及临床患者辐照损伤提供优化和治疗方法。
1.1 材料
1.1.1 动物：8 周雌性SPF级C57BL/6小鼠(中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心)；
8周雌性SPF级红色荧光小鼠(actin-IRES-tdTomato)(上海南方模式生物科技股份有限公司)。
1.1.2 主要试剂：Zombie VioletTMFixable Viability Kit (Biolegend公司)；
小鼠活性氧簇(ROS)ELISA 检测试剂盒(酶联生物公司)；
CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒(Promega公司)；
Annexin V-APC 凋亡检测试剂盒(BD公司)；
CellROXTMGreen Reagent(Invitrogen公司)；
动物RNA抽提试剂盒(碧云天公司)；
反转录试剂盒(Applied Biosystems公司); SYBR Green预混液(Bio-Rad公司)；
StemSpan SFEM Medium无血清造血干细胞培养基(STEMCELL Technologies公司)。
1.2 方法
1.2.1 骨髓细胞的分离：小鼠脱颈椎处死后，浸泡乙醇消毒，无菌操作分离出小鼠股骨，使用1 mL注射器吸取PBS冲洗出骨髓细胞，过滤后500×g离心5 min，使用红细胞裂解液裂解红细胞，再次离心5 min得到沉淀为骨髓细胞。
1.2.2 动物实验分组及处理：将小鼠分为9 Gy辐照组和12 Gy辐照组，每组6只。小鼠辐照使用生物辐照仪Rad Source RS2000，选择辐照剂量率为1.209 Gy/min，间隔4 h分两次进行辐照，每次辐照3 min 43 s的累计剂量即为9 Gy，每次辐照4 min 58 s的累计剂量即为12 Gy。辐照后12 h内每只小鼠尾静脉移植供体骨髓细胞3×106个，供体骨髓细胞来自红色荧光小鼠(actin-IRES-tdTomato)，记录小鼠生存情况。移植后每周1次采集受体小鼠外周血，使用流式细胞仪检测外周血细胞总数、供体细胞嵌合率和数量，比较不同辐照剂量对骨髓移植的影响。
将骨髓移植小鼠分为CH223191治疗组和对照组，每组5只；
药物治疗组小鼠骨髓移植前后每两天腹腔注射CH223191 (10 mg/kg)共8次，对照组腹腔注射药物溶剂；
小鼠间隔4 h分两次进行12 Gy辐照，辐照后12 h内每只小鼠尾静脉移植供体骨髓细胞3×106个，记录小鼠体质量；
移植后每周1次采集受体小鼠外周血，使用流式细胞仪检测供体细胞嵌合率和数量；
小鼠骨髓移植1个月后，取受体小鼠股骨，检测骨髓中供体细胞嵌合率。
1.2.3 分离小鼠血清及ELISA检测血清ROS：从C57BL/6小鼠眼眶静脉丛采血，待血液凝固后，3 000 r/min离心10 min，小心吸取上层液体即为血清。使用试剂盒进行ROS检测，设置标准品孔和样本孔，分别加入标准品或稀释后的小鼠血清，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体后37 ℃ 1 h，洗板后加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入终止液后在 450 nm 波长处测定各孔的A值，计算得出血清ROS相对水平。
1.2.4 供体骨髓细胞体外实验分组和处理：骨髓细胞使用StemSpan SFEM Medium无血清造血干细胞培养基并添加细胞因子进行体外培养。将供体骨髓细胞分为对照组、9 Gy辐照组和12 Gy辐照组，分别于培养基中加入未辐照小鼠血清、9 Gy辐照小鼠血清和12 Gy辐照小鼠血清100 μL，处理24 h后收集细胞检测。将辐照血清处理的供体骨髓细胞分为DMSO组和CH223191组，CH223191组加入浓度为2 μmol/L的CH223191，DMSO组加入DMSO，处理24 h后收集细胞检测。
1.2.5 细胞活力的检测：使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒测定细胞活力，该试剂盒基于荧光素酶反应测定活细胞中ATP的量，细胞中ATP的量与细胞活力相关，根据荧光强度即可反映出细胞活力。
1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ROS：用Annexin V-APC 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况，收集处理后的骨髓细胞1×106个并用PBS清洗2次，100 μL 结合缓冲液重悬，加入5 μL Annexin V-APC和1 μL 7-AAD，室温避光孵育15 min，加入400 μL结合缓冲液中和，上机检测；
收集处理后的骨髓细胞，100 μL PBS重悬，加入CellROXTMGreen Reagent 0.5 μL，避光37 ℃ 0.5 h，PBS洗3遍后上机检测。该实验使用Thermo Fisher公司Attune NxT流式细胞仪，所有数据均采用FlowJo 10.5.3统计分析。
1.2.7 RT-qPCR检测mRNA：使用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转为cDNA，使用SYBR Green 预混液配制相应的PCR反应体系。
1.3 统计学分析
2.1 高剂量辐照不利于小鼠骨髓移植
C57小鼠分别经过不同剂量的X线辐照后，未进行骨髓移植小鼠均在6～11 d死亡，进行骨髓移植小鼠均能存活，重建造血系统(图1A)。辐照后第2天，小鼠外周血细胞总数与未辐照小鼠相比出现明显下降(P<0.01)，并且12 Gy辐照组小鼠外周血细胞数少于9 Gy辐照组(P<0.05)(图1B)。然而骨髓移植后1个月内，12 Gy辐照组小鼠外周血供体细胞嵌合率与9 Gy辐照组相比无明显差异(图1C)。骨髓移植后第7、14、21天，12 Gy辐照组小鼠外周血供体细胞数明显少于9 Gy辐照组(P<0.05)(图1D)。
2.2 辐照小鼠的血清使骨髓细胞活力下降
小鼠经辐照后，血清ROS水平明显上升， 且12 Gy辐照组血清ROS水平高于9 Gy辐照组(P<0.01)(图2A)。经辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞活力低于未辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞，并且辐照剂量越大，血清对骨髓细胞活力影响更显著(P<0.001)(图2B)。辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞凋亡比例高于对照组，且高剂量辐照组血清处理后，骨髓细胞凋亡比例高于低剂量辐照组，活细胞比例则相反(P<0.05)(图2C)。
A.survival of transplantation group and control group with different radiation doses; B.peripheral blood cells of mice after irradiation; C.donor cells chimerism rate in peripheral blood of mice after bone marrow transplantation; D.number of donor cells in peripheral blood of mice after bone marrow transplantation; *P<0.01， **P<0.001 compared with control group，#P<0.05 compared with 9 Gy group
2.3 CH223191通过抑制AHR提高骨髓细胞活力
辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞中的AHR下游基因Cyp1a1与Cyp1b1mRNA均升高(P<0.05)(图3A)。辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞加入CH223191后，Cyp1a1与Cyp1b1mRNA水平降低， AHR激活被抑制(P<0.05)(图3B)。辐照小鼠血清处理的骨髓细胞加入CH223191处理后，细胞活力明显高于DMSO组(P<0.001)(图3C)。CH223191组细胞内ROS水平低于DMSO组(P<0.001)(图3D)。CH223191组细胞凋亡比例减少，活细胞比例增多(P<0.01)(图3E)。
2.4 CH223191能够提高小鼠骨髓移植效果
CH223191治疗组小鼠体质量在辐照后第8、15、22天相对于对照组减轻较少(P<0.05)(图4A)。骨髓移植后1个月内，CH223191治疗组小鼠外周血供体细胞嵌合率高于对照组(P<0.05)(图4B)，外周血供体细胞数明显多于对照组(P<0.05)(图4C)。在小鼠骨髓移植1个月后，CH223191治疗组小鼠骨髓内供体细胞比例高于对照组，且供体骨髓细胞数比对照组明显增多(P<0.05)(图4D)。
A.relative levels of ROS in irradiated mice serum; B.cell viability of bone marrow cells treated with mouse serum measured by ATP cell viability assay; C.apoptosis of bone marrow cells treated with serum from different irradiated mice; *P<0.01,**P<0.001 compared with control group; #P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 compared with 9 Gy group
A.expression of AHR,Cyp1a1,Cyp1b1 mRNA in bone marrow cells treated with irradiated mouse serum detected by fluorescence quantitative PCR; B.expression of AHR, Cyp1a1,Cyp1b1 mRNA in bone marrow cells treated with DMSO and CH223191 detected by fluorescence quantitative PCR;C.cell viability of bone marrow cells treated with DMSO and CH223191 measured by ATP cell viability assay; D.levels of ROS in bone marrow cells treated with DMSO and CH223191；
E.apoptosis of bone marrow cells treated with DMSO and CH223191; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control group
在本研究中，接受骨髓移植的小鼠在全身辐照后，自身骨髓细胞与免疫细胞明显减少，并且更大剂量的辐照具有更明显的清除效果。而高效的清除效果并不能够提升骨髓移植后的供体细胞嵌合率，因为移植相同数量的骨髓细胞后，高剂量辐照小鼠体内存活的供体细胞明显少于低剂量辐照组。在体外检测辐照小鼠血清中ROS水平时发现，小鼠经辐照后，血清ROS水平明显上升，且12 Gy辐照组血清ROS水平高于9 Gy辐照组。未经辐照的供体细胞在体外接受辐照小鼠血清处理后，表现出了细胞活力下降，细胞凋亡增加的现象，原因就在于辐照产生的不利因素如ROS对未经辐照的供体细胞同样造成损伤。本研究发现经辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞AHR被激活，AHR激活后通过细胞色素P450在胞内诱导产生更多ROS，胞内的ROS累积严重影响HSC的自我更新与分化能力。而CH223191作为AHR特异性拮抗剂，阻断AHR信号通路后，能够降低供体细胞内ROS水平，明显提高了骨髓细胞的活力。在体内骨髓移植实验中，使用CH223191治疗的受体小鼠状态和骨髓移植后的供体细胞嵌合率均有一定改善，从而达到了更好的骨髓移植效果。
A.weight of mice treated with CH223191 after bone marrow transplantation; B.donor cells chimerism rate in peripheral blood of mice treated with CH223191 after bone marrow transplantation; C.number of donor cells in peripheral blood of mice treated with CH223191 after bone marrow transplantation; D.proportion and number of donor bone marrow cells in mice treated with CH223191 after bone marrow transplantation; *P<0.05 compared with control group
此外，RIBE在人造血干细胞中同样得到证明，移植后的人HSC由于氧化应激产生更强的DNA损伤、细胞周期停滞和p53依赖性细胞凋亡[8]。同时，在肿瘤放射治疗中，RIBE和辐照的非靶向作用也导致了非辐照组织表观遗传功能障碍，DNA损伤和细胞死亡，因此辐射致癌机制也是目前临床上亟需解决的问题之一[9]。本研究证明CH223191对移植骨髓细胞具有保护作用，还需要进一步研究该结论是否适用于人的造血干细胞以及能否解决临床造血干细胞移植问题，对于解决肿瘤放射治疗中非辐照组织的旁观者效应也具有潜在的研究意义和应用前景。
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