田 良，孙 瑞，陈 雪，李婷婷，许建峰，3，4，李仕豪，孙博文，马兰洁，杨忠明
(1. 宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；
2. 平罗县中医院，宁夏 平罗 753400；
3. 宁夏医科大学总医院，宁夏 银川 750004；
4. 宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004；
5. 银川市中医院，宁夏 银川 750001)
腰椎间盘突出症慢性疼痛是一种难治性疼痛，患者会出现多部位疼痛、肌肉僵直、焦虑、抑郁等，严重影响患者的生活质量。当机体发生疼痛时，躯体感觉通路被激活，除外周炎性损伤外，中枢系统也会发生一系列的复杂变化。其中中枢敏化是疼痛超敏的主要原因，也是痛觉过敏的主要病理基础[1]。国际疼痛研究协会将中枢敏化定义为中枢神经系统中伤害感受神经元对其正常或阈下传入输入的反应性增加[2]。烙灸疗法是将艾绒放置于特制器具中点燃并直接烙于病痛部位，使局部发红或发泡，促使机体康复的一种治疗方法[3]。前期研究发现，烙灸可以介导Fas/FasL信号通路促进腰椎间盘突出后髓核重吸收[4]，且临床应用可有效改善腰椎间盘突出症所引起的痛觉过敏，但机制不明确。因此，本研究采用腰椎间盘突出症慢性疼痛中枢敏化模型，通过观察烙灸对L4～6脊髓节段脊髓中小胶质细胞和星胶质细胞的表达及相关炎症因子含量的影响，探讨烙灸干预腰椎间盘突出症慢性疼痛脊髓中枢敏化的机制，以期为后续实验提供基础，为临床治疗提供理论依据。
1.1实验动物 选择健康Sprague-Dawley(SD)标准体重雄性大鼠45只，由宁夏医科大学动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(宁)2020-0001。每日喂食标准克数纯净水和饲料。适应性饲养5 d后进行实验。实验过程符合宁夏医科大学伦理委员会标准(IACUC-NYLAC-2021-004)。
1.2主要试剂及仪器 苏木素染色液(珠海贝索生物技术有限公司，BA-4041)，分化液(上海碧云天生物技术有限公司，C0163M)，伊红染液(珠海贝索生物技术有限公司，BA-4024)，二甲苯(天津市永大化学试剂有限公司)，中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9555)，DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9018)，二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-6001)，Iba1一抗(Affinity，DF6443)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)一抗(博奥森，bs-0199R)，白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒(联科生物/大鼠脊髓，货号分别为EK301B/3和EK382/3)，光学显微镜(日本OLYMPUS，BX43)，石蜡切片机(德国莱卡RM2135)，成像系统(日本OLYMPUS，UC90)，电子Von Frey测痛仪(上海玉研科学仪器有限公司)。
1.3实验方法 将45只大鼠编号并随机分为空白对照组、模型对照组和烙灸组，每组15只。术前1 d观察大鼠一般行为，检测左侧足底触觉痛阈值。模型对照组和烙灸组大鼠禁食禁水6 h后，采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠固定于手术台上，腰骶部备皮(5 cm×4 cm)。用碘伏在术区消毒3遍并铺设消毒巾。根据体表标志定位法定位大鼠髂前上棘(髂前上棘平对L4椎体)来确定L4～6位置，以其为中心，沿背部中线做2.5 cm左右纵向切口，依次分离大鼠的皮肤、皮下组织及腰背筋膜，顺着棘突左侧剥离骶棘肌，暴露左侧L5、L6椎板、横突及乳状突，用弯头止血钳侵蚀法咬除，显露神经根及背根神经节。接着在大鼠尾根部约1 cm处切断尾巴，用眼科镊取2～3个髓核(约10 mg)，小心移植到L5、L6神经根处，在髓核表面移植可吸收明胶海绵贴，逐层缝合切口并消毒。断尾处进行碘酒消毒缝合并用无菌纱布进行包扎，防止伤口感染。术毕将大鼠平铺在保温箱内，待大鼠麻醉苏醒后放回笼中，连续3 d肌注庆大霉素2 mL防止感染。术后30 d，评估大鼠一般行为、术侧足底触觉痛阈值，达到中枢敏化标准(触觉痛阈值低于大鼠基础痛阈值的50%)的大鼠进行后续实验，不符合标准的剔除，最终2组各有10只大鼠造模成功。术后30 d开始，烙灸组大鼠进行烙灸干预：将烙灸器沿腰椎纵轴方向放置，覆盖L1～6椎体表面，点燃灸槽内艾绒，烙致局部皮肤出现潮红，1次/d，每次10 min，干预60d。模型对照组大鼠在固定器上固定10min，1次/d，不予其他干预；
空白对照组大鼠不予造模，不予干预。
1.4取材方法 实验结束后，10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，用手术剪迅速剪开胸腔并暴露心脏及升主动脉。使用无菌静脉输液器，注射器针头从心尖处进针，穿过左心室，插入升主动脉根部后固定针头，剪开右心耳，以做灌注液流出口。随后迅速灌入4 ℃生理盐水，观察灌注液血色变淡、大鼠的肺脏及肝脏颜色减退且肠系膜血管中的血液消失后改用多聚甲醛(pH 7.4)进行快速固定，大鼠四肢伸展后减慢灌注速度。当大鼠全身僵硬视为灌注成功。最后钳断大鼠腰部脊椎骨，小心剥离脊髓，放入包埋盒。
1.5检测指标及方法
1.5.1大鼠行为学及左侧足底触觉痛阈值 术后30 d后，每间隔10 d，在大鼠清醒状态下，采用爪触痛仪测定左侧足底触觉痛阈值。将大鼠放入30 cm×45 cm×30 cm的测试箱内，适应环境后通过触痛仪显示屏，将触针对准大鼠左侧后足掌面，单击鼠标，触针将从筛网下部持续垂直刺激大鼠足底掌面，当大鼠出现缩足反应时视为阳性，刺激强度以数值方式显示在屏幕中，此数值为大鼠左侧足底触觉痛阈值，共检测3次，每次间隔5 min，取平均值。
1.5.2脊髓组织病理形态 将组织样本常规石蜡包埋切片，加入苏木素染液染3～5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；
切片依次入85%、95%的梯度乙醇脱水各5 min，入伊红染液中染色5 min；
切片依次放入无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ5min、无水乙醇Ⅲ5min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ 5min透明，中性树胶封片；
光学显微镜观察脊髓组织一般形态结构。
1.5.3脊髓组织中IL-1β、TNF-α含量 酶联免疫吸附实验 (ELISA) 测定大鼠脊髓组织中IL-1β、TNF-α含量：将脊髓组织做匀浆处理，4 ℃保存备用。在酶标包被板上的样品孔中依次加入样品稀释液40 μL、待测样品10 μL，将待测样品稀释5倍；
封板膜封板后置于37 ℃温育30 min，洗涤，在各反应孔中加新鲜稀释的酶标抗体50μL继续温育30min，洗涤，加底物液50μL 显色，避光反应15 min，加入终止液25 μL，在450 nm波长下读取光密度(OD)值。
1.5.4脊髓中小胶质细胞标记物Iba1和星形胶质细胞标记物GFAP表达情况 采用免疫组化法检测：制作石蜡片、水化脱蜡、PBS清洗脱水、滴加一抗，PBS清洗、滴加二抗，PBS清洗后DAB染色，PBS清洗，苏木精复染5 min、自来水清洗5 min、脱水、透明、封固、显微镜观察，采集图像。
2.1各组大鼠行为学表现 造模前，大鼠精神饱满，情绪稳定，毛发有光泽，运动自如，二便、饮食均正常。造模后，由于术后反应，大鼠精神欠佳，饮食较少，活动较迟缓；
术后30 d后，大鼠出现烦躁、焦虑、易激惹现象，自噬情况严重，反复舔足，频繁摆动短尾，后肢仍无力，中度跛行，已出现中枢敏化表现。烙灸组大鼠干预30 d后，精神状态逐渐稳定，自噬伤口逐渐愈合，后肢仍无力，中度跛行；
干预60 d后，精神状态基本恢复正常，自噬伤口已愈合，后肢仅有轻度跛行。
2.2各组大鼠左侧足底触觉痛阈值 术前3组大鼠左侧足底触觉痛阈值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；
术后30～90 d，模型对照组与烙灸组大鼠左侧足底触觉痛阈值均明显低于同期空白对照组(P均<0.05)，且造模2组大鼠左侧足底触觉痛阈值术后50 d内逐渐降低，术后50 d后逐渐升高，术后70 d后趋于稳定，但烙灸组术后40～90 d左侧足底触觉痛阈值均明显高于同期模型对照组(P均<0.05)。见表1。
表1 空白对照组和腰椎间盘突出症各组大鼠左侧足底触觉痛阈值比较
2.3各组大鼠脊髓组织病理形态 空白对照组大鼠脊髓形态结构正常，灰质区神经元胞体形态饱满，突起完整；
尼氏小体数量较多；
纤维间有胶质细胞存在。模型对照组脊髓有明显损伤，灰质区神经元固缩，少量神经元坏死、消失；
尼氏小体减少甚至消失，神经胶质细胞数量较空白组增多，毛细血管增多。烙灸组脊髓损伤较模型组有所减轻；
灰质区神经元胞体形态较饱满，突起较完整；
灰质区神经元少量固缩，尼氏小体数量较模型组增加。见图1。
箭头1示胶质细胞；
箭头2示尼氏小体；
箭头3示固缩神经元图1 空白对照组和腰椎间盘突出症各组大鼠脊髓组织HE染色病理形态(×200)
2.4各组大鼠脊髓组织中IL-1β和TNF-α含量模型对照组大鼠脊髓组织中IL-1β与TNF-α含量均明显高于空白对照组(P均<0.05)，烙灸组均明显低于模型对照组(P均<0.05)。见图2。
图2 空白对照组和腰椎间盘突出症各组大鼠脊髓组织中IL-1β与TNF-α含量
2.5各组大鼠脊髓组织中Iba1和GFAP表达情况空白对照组中星胶质细胞和小胶质细胞未见明显活化，细胞中也未明显表达GFAP与Iba1；
模型对照组中两个胶质细胞明显被激活表达，其标记物GFAP与Iba1大量存在于胶质细胞中，平均光密度值明显高于空白对照组(P均<0.05)；
烙灸组中两个胶质细胞活化表达相对于模型对照组降低，细胞中GFAP与Iba1的平均光密度值明显低于模型对照组(P均<0.05)。见图3及图4。
图3 空白对照组和腰椎间盘突出症各组大鼠脊髓组织中Iba1和GFAP表达情况(免疫组化)
图4 空白对照组和腰椎间盘突出症各组大鼠脊髓组织中Iba1和GFAP表达平均光密度值
腰椎间盘突出症病变部位涉及督脉。督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属与脑，为阳脉之海[5]。《素问·骨空论》：“督脉为病，脊强反折。”[6]《难经·二十九难》：“督之为病，脊强而厥。”烙灸是宁夏少数民族医学的特色疗法，烙灸的理论基础在吸收“体液学说”及“四津学说”的基础上融合了传统中医的气血津液理论，不断发展形成独具特色的“四性四液学说”[7]。“四体液”指黑液、红液、黄液、白液，均为人身血肉精气之本；
“四性”即冷、热、干、润，在正常生理情况下，称为“四禀性”，“四性”与“四液”协同，调控人体正常活动，抵御内外界的各种干扰，从而维护正常生理功能[8]。烙灸疗法是中医化脓灸的发展与深化，通过烙铁强大的穿透力，使背部皮肤在感受到热刺激后鼓动阳气，使经气上下相通，缓解肌张力过高状态，达到补火助阳、通络益髓之效。因此烙灸督脉不仅可以治疗腰椎间盘突出症所带来的疼痛症状，还可以激发人体阳气。岳倩文[7]研究证实烙灸可以促进脊髓损伤大鼠肢体运动及感觉功能恢复，可激活体内内源性神经干细胞增殖，减少星形胶质细胞过度分化，诱导其向神经元及少突胶质细胞分化。
中枢敏化是指脊髓背角对周围神经刺激反应性增强而导致的痛觉过敏[9]，这种增强会使痛阈降低，疼痛反应放大，疼痛敏感性扩散到非损伤区域。外周伤害性信息在向大脑高级中枢神经系统传导的过程中痛觉信息可能会被阻抑，也可以保持不变或者放大，即痛觉过敏，而调节和整合这种信息的第一级中枢就是脊髓背角[10]。近些年研究表明，脊髓背角中胶质细胞的激活与痛觉过敏的产生和疼痛的维持关系密切[11]。目前认为，小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统中与疼痛密切相关的两大胶质细胞。小胶质细胞是中枢神经系统中的巨噬细胞，对外周伤害性刺激十分敏感，是神经系统中反应最快的细胞，当中枢神经系统受到外周伤害性刺激后小胶质细胞迅速激活，活化的小胶质细胞会合成和释放多种细胞因子及趋化因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，这些释放的细胞因子将活化痛觉传导的神经元，导致中枢敏化[11]。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型，在疼痛敏化中扮演重要的角色，当中枢神经系统受到持续伤害性刺激时星形胶质细胞被活化，而后释放大量的炎症介质以及促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6等，这些炎症介质能够进一步激活胶质细胞本身和神经元，增加了神经元的兴奋性，促进了中枢敏化[12]。本实验结果显示，模型对照组脊髓组织中Iba1与GFAP表达增高，结合大鼠行为学，说明模型复制成功；
与模型对照组相比，烙灸组大鼠脊髓组织中Iba1与GFAP表达减少，说明烙灸疗法可以改善腰椎间盘突出症引起的慢性疼痛中枢敏化现象。
炎症因子已经被证实可直接结合神经元上相应受体，提高神经元兴奋性介导疼痛[13]。Kawasaki等[14]利用膜片钳技术记录了脊髓切片内Ⅱ层神经元电位，发现TNF-α、IL-1β和 IL-6可快速调节α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体 (AMPAR)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)和γ-氨基丁酸受体 (GABAR) 等神经递质受体的功能，导致脊髓疼痛回路兴奋性突触传递增强和抑制性突触传递抑制，从而直接诱导中枢敏化,而这一发现与体外实验研究结果是一致的，提示TNF-α、IL-1β和IL-6可直接促进中枢敏化介导疼痛。本实验结果显示，模型对照组大鼠脊髓组织中TNF-α和IL-1β含量明显高于空白对照组，烙灸组明显低于模型对照组。这提示炎症因子确实参与腰椎间盘突出症慢性疼痛中枢敏化的发生，同时烙灸疗法可以减少炎症因子的表达，抑制中枢敏化的发生。
综上所述，烙灸可以明显缓解腰椎间盘突出症疼痛，其机制可能与抑制脊髓胶质细胞的活化，减少炎症因子分泌，减轻中枢敏化有关。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
猜你喜欢 敏化胶质空白对照 外源性透明质酸对人牙周膜细胞增殖及成牙骨质、成纤维分化的影响中日友好医院学报(2022年4期)2022-10-15穴位敏化柔性辅助检测传感器的研发世界科学技术-中医药现代化(2022年2期)2022-05-25冠心病穴位敏化现象与规律探讨世界科学技术-中医药现代化(2021年8期)2021-12-21近5年敏化态与非敏化态关元穴临床主治规律的文献计量学分析世界科学技术-中医药现代化(2021年7期)2021-11-04人类星形胶质细胞和NG2胶质细胞的特性神经损伤与功能重建(2020年11期)2020-12-01例析阴性对照与阳性对照在高中生物实验教学中的应用看世界·学术下半月(2020年7期)2020-09-10小胶质细胞——阿尔茨海默病中重新回炉的热点广东医科大学学报(2020年6期)2020-02-06铜的硫化物对电极在量子点敏化太阳能电池中的应用陶瓷学报(2019年5期)2019-01-12过表达H3K9me3去甲基化酶对猪克隆胚胎体外发育效率的影响（内文第 96 ～ 101 页）图版广东农业科学(2017年10期)2018-01-25镜像治疗截肢后幻肢痛的随机对照试验中国医学创新(2017年22期)2017-11-15