李 冰，陈 靖，于素香，朱凤池，闫江鹤，赵秀娟，冯 璞，陈苗凤，贾金娜
结肠腺癌是结肠癌中最常见的一种亚型，由于缺乏显著的早期症状，多数患者在就诊时已处于进展期[1]。进展期结肠腺癌具有高侵袭性，导致结肠腺癌患者的死亡率升高[2-3]。目前结肠腺癌的治疗手段主要包括手术治疗、放化疗及联合治疗等，尽管取得一定进展，但仍然难以满足多数进展期患者的生存需求。多个针对结肠腺癌的分子靶点如SIRT6、CXCR2等相继被发现[4-5]。Kinesin家族成员C1（kinesin family member C1,KIFC1）也称作HSET，是Kinesin超家族的一个马达蛋白[6]。近年来，KIFC1在肿瘤发生发展过程中的重要作用被越来越多地揭示出来[7-9]。由于KIFC1在癌细胞的多个中心体聚集中发挥关键作用，因此已被认为是一个潜在的化疗靶点。此外，KIFC1也被发现通过稳定一定程度的遗传不稳定性、延迟细胞周期和保护癌细胞存活信号，主动驱动肿瘤的恶性和转移[10-12]。然而，KIFC1是否可影响结肠癌的发展仍然未知。本研究主要探讨KIFC1在结肠癌组织样本中的表达和临床意义，并利用短发夹RNA（shRNA）敲低结肠腺癌细胞系KIFC1的表达，评估KIFC1调控结肠腺癌细胞增殖能力的作用，以期为基于KIFC1的靶向治疗提供临床和实验室依据。
1.1 临床资料 选取来自保定市第四中心医院、天津市肿瘤医院和保定第二医院的结肠腺癌手术治疗患者122例，其中男性66例，女性56例；
年龄42～78岁，平均53.2岁；
临床分期I～II期68例，III～IV期54例；
肿瘤病理高分化78例，低分化44例；
有淋巴结转移56例，术后均经病理证实为结肠腺癌。排除标准为有病理证实并非结肠腺癌、存在第二原发肿瘤、存在全身广泛转移或存在手术切除禁忌等。
1.2 实验材料 试剂：Anti-KIFC1抗体（ab172620，美国Abcam公司）；
抗核抗体（1:1000稀释，中国Sanying公司）；
二氨基苯胺（中国上海Cell Signaling科技公司）；
胎牛血清（04-100-1ACS，以色列 BI公司）；
Lipofectamine 2000（11668069，美 国 Invitrogen公 司 ）；
MTT（298931）、DMSO（67685）、结晶紫（548629）均购自美国Sigma公司；
Trizol试剂（15596026，美国Invitrogen公司），第一链cDNA合成试剂盒（K1621，美国Thermo公司），FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（瑞士罗氏公司）；
β-肌动蛋白（ab179467，1:1000，美国Abcam公司）。本试验中涉及的仪器如下：ABI 7900HT QPCR Cycle，微板阅读器（美国Thermo 公司），PVDF膜（北京智杰方远科技有限公司）。细胞系：结肠癌细胞系HCT116和HT29（国家实验细胞资源共享平台，北京）。
1.3 免疫组织化学染色及评分标准 采用免疫组织化学染色实验检测KIFC1在结肠腺癌患者的肿瘤组织及其对应的癌旁组织（距离肿瘤组织3～5 mm的结肠正常组织）中的表达水平。用福尔马林固定肿瘤组织，行石蜡包埋与切片后，于75 ℃加热30 min，用二甲苯脱蜡，并用梯度乙醇（100%、100%、95%、85%、75%）水合。用柠檬酸缓冲液孵育15 min提取抗原，并阻断内源性过氧化物酶5 min，5% BSA封闭切片20 min，随后使用抗KIFC1的抗体（1︰100稀释）孵育2 h，生物素化的二抗（1︰1000稀释）孵育1.5 h，二氨基苯胺作为显色剂底物，洗涤染色5 min后用显微镜采集图像。评分标准如下[8]：阳性细胞：肿瘤细胞阳性率<5%记为0分，肿瘤细胞阳性率5%～25%记为1分，肿瘤细胞阳性率25%～75%记为2分，肿瘤细胞阳性率>75%记为3分。同时对阳性染色的肿瘤细胞膜及胞浆染色强度进行评分：阴性染色记为0分，弱阳性染色记为1分，中度阳性染色记为2分，强阳性染色记为3分。随后将阳性细胞百分比评分和染色强度评分相加，分为高表达（3～6分）和低表达（0～3分）。每个患者的肿瘤组织切片选取5个视野观察。最终结果采用双盲法进行判断。
1.4 细胞系培养并利用shRNA敲低KIFC1 将结肠癌细胞系HCT116和HT29用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，孵育于二氧化碳浓度为5%，温度为37 ℃的培养箱中。转染前1 d将细胞种植在24孔板上，使用shRNA（序列AAATTACCACATCCCACCCAAGA） 感 染HCT116和HT29细胞，转染试剂为Lipofectamine 2000，将50 μL转染复合物滴加到培养基中，混合均匀，转染后12 h观察细胞形态，继续培养48 h。
1.5 RNA提取和实时定量PCR 根据Trizol试剂从转染KIFC1 shRNA的HCT116细胞和HT29细胞中提取总RNA，用第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，使用ABI 7900HT QPCR Cycle和 FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）进行实时定量PCR实验。GAPDH已经被规范化，并使用2-∆∆Ct法计算相对表达量。β-actin引物：5’-CAGCTCACCATGGATGATGATATC-3’和 5’-AAGCCGGCCTTGCACAT-3’，KIFC1 引物：5’-TGAGCAACAAGGAGTCCCAC-3’ 和5’-TCACTTCCTGTTGGCCTGAG-3’。
1.6 Western blotting 用PBS缓冲液洗涤细胞，并用细胞裂解液裂解细胞以提取总蛋白，用BCA蛋白质分析试剂盒（PC0020，中国索莱宝公司）定量。将20 μg蛋白质样品与上样缓冲液混合，进行SDS-PAGE电泳及转膜。之后用溶于TBST缓冲液中的5%脱脂牛奶封闭膜1 h，在4 ℃下与一抗（KIFC1、PCNA、Ki67、β-actin）孵育过夜。然后使用TBST缓冲液洗涤3次，与特异性的HRP结合的二抗孵育，滴加显影液在曝光仪中进行检测。结果用相对表达量进行半定量统计分析。
1.7 MTT实验 对照组和转染后细胞以每孔5000个的密度接种于96孔板中，72 h后添加10 μL浓度为5 mg/mL的MTT培养6 h。抽吸培养基并将MTT溶解于100 μL DMSO中，使用酶标仪在570 nm处读取吸光度。
1.8 克隆形成实验 细胞转染后24 h计数，并以每孔300个细胞的密度分3次接种到6孔板中，然后培养8 d。培养基每4天更换1次，然后用结晶紫染色，计数超过50个细胞的菌落。
1.9 统计学方法 采用GraphPad软件进行统计分析。计数资料以例（%）表示，采用卡方检验比较不同临床病理特征患者KIFC1蛋白表达情况的差异。剂量资料以（均值±标准差）表示，两组比较用t检验。利用Kaplan-Meier方法比较KIFC1低表达与高表达结肠腺癌患者的总生存期和无病生存期。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 KIFC1在结肠腺癌组织样本中高表达 KIFC1主要定位在结肠腺癌细胞的细胞核中，相对于癌旁组织，KIFC1在结肠腺癌中呈明显高表达，见图1。
图1 KIFC1在结肠癌组织及癌旁组织中的表达情况比较（免疫组织化学法，上图为×100，下图为×200）
2.2 KIFC1与结肠腺癌患者临床病理特征的关系根据KIFC1的染色强度，将结肠癌患者的肿瘤组织样本分为KIFC1高表达组（60例）和KIFC1低表达组（62例），比较两组结肠腺癌患者的临床特征发现，KIFC1的表达水平与结肠腺癌患者的肿瘤T分期及临床分期紧密相关，高表达组的T3～4期和III～IV期患者比例高于低表达组，差异有统计学意义；
而两组其他临床特征差异无统计学意义（表1）。
表1 122例结肠癌组织中KIFC1高表达组和低表达组的临床病理特征比较
2.3 KIFC1表达水平与结肠腺癌患者的不良预后显著相关 高表达KIFC1组结肠腺癌患者具有更低的总生存期及无进展生存期（χ2=12.510、21.561，P=0.0007、P<0.0001， 图 2）， 表 明KIFC1的表达水平与结肠腺癌患者的不良预后显著相关，提示KIFC1可能在结肠腺癌的发生发展过程中起重要作用。
图2 KIFC1的表达水平与结肠腺癌患者总生存期和无进展生存期的相关性
2.4 敲低结肠癌细胞中KIFC1表达水平抑制其增殖能力 使用shKIFC1慢病毒载体感染HCT116和HT29细胞后，通过实时定量PCR和Western blotting验证其在基因和蛋白水平敲低KIFC1的效率，发现实验组细胞HCT116和HT29被shKIFC1慢病毒感染后，KIFC1基因和蛋白表达水平明显降低（图3）。随后，利用MTT实验分析发现，接种细胞72 h后，对比对照组，敲低KIFC1组细胞增殖明显下降。为进一步证明KIFC1能否调控结肠癌细胞的增殖能力，本研究检测了增殖的标志物Ki67和PCNA的表达水平，发现无论是集落形成数还是增殖标志物的表达量，敲低KIFC1后，均明显下降（图4）。
图3 shRNA转染结肠癌细胞后KIFC1基因mRNA（A）和蛋白（B）表达水平降低
图4 在结肠癌细胞系中敲低KIFC1表达抑制细胞的增殖和相关蛋白表达
结肠腺癌是一种高发病率及高死亡率的恶性肿瘤[3]。由于缺乏显著的早期症状及高转移性，现有的治疗手段，如放疗、化疗等均难以起到预期的治疗效果[1]。近年来靶向治疗受到更多关注，多个结肠腺癌靶向治疗药物被发现，少数已处于临床实验阶段[13]。本研究发现KIFC1在结肠腺癌组织中呈高表达，并且与结肠腺癌患者的不良预后紧密相关，提示其在结肠腺癌发展过程中可能具有重要作用。近年来，KIFC1在肿瘤发生发展过程中的重要作用被越来越多地揭示出来：多篇文献证实KIFC1在多种肿瘤组织中高表达，并与其不良预后有关[9-11]。KIFC1影响非小细胞肺癌及肾细胞癌的增殖，影响肝细胞癌的转移及不良预后[11]，KIFC1可作为三阴性乳腺癌不良预后的生物标志物[8-10]。有研究报道，KIFC1可沿着微管并朝向负末端移动，从而参与货物转运[6]，KIFC1还参与有丝分裂纺锤体的形成及纤毛发生[7]，可调控高尔基体的形成、定位及高尔基体相关囊泡的转运[7]。近年来，KIFC1在肿瘤发生发展过程中的重要作用被越来越多地揭示出来：多篇文献证实KIFC1在多种肿瘤组织中高表达，与多中心体的形成有关[12]，并与不良预后有关[10-12]：Han等[9]发现KIFC1水平升高与肝细胞癌的不良预后和转移相关。此外，KIFC1在体外和体内都诱导上皮-间质转化（EMT）和肝细胞癌转移；
且KIFC1过表达增强了肝癌细胞增殖和病灶形成，而KIFC1敲除抑制了肝癌细胞的生长和病灶形成。本研究发现KIFC1在结肠腺癌组织中的高表达，并且与结肠腺癌患者的不良预后紧密相关，提示其在结肠腺癌发展过程中可能具有重要作用。同时，本研究通过细胞实验发现，成功建立的稳定敲除KIFC1的细胞系，对比对照组，其细胞存活率明显减少，形成的集落数也明显减少，并且增殖标志物Ki67以及PCNA的表达水平也明显降低，暗示其可能在调控结肠癌细胞增殖方面起到至关重要的作用，可以作为结肠腺癌治疗有效的分子靶点，但精细的分子机制仍需进一步研究。
Kinesin可参与中心体复制的调控，KIFC1的过表达会导致肿瘤细胞多级纺锤体的形成[6]。本研究发现敲低KIFC1在体外水平能够明显影响结肠癌细胞的增殖水平，其表达水平也与结肠腺癌的不良预后显著相关。而除了增殖外，KIFC1也通过别的方式调控肿瘤生长：KIFC1可作为微管与高尔基体的桥梁，从而维持高尔基体的定位与形态[7]；
同时，高尔基体的囊泡运输也受到KIFC1的调控。
这些基于Kinesin家族蛋白对肿瘤影响的研究，结合本研究中已证实KIFC1参与结肠癌细胞的增殖调控的结论，以及临床样本中验证的高表达KIFC1与进展的临床分期以及不良预后相关，证实了Kinesin这一马达蛋白家族在肿瘤发生发展中的重要作用，提示这类蛋白可作为肿瘤治疗的潜在靶点，从而发挥重要的临床价值。
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