吕 斌，凌圣惠，黎高文，梁 艳
广西壮族自治区玉林市第一人民医院感染管理科，玉林 537000
萝卜硫素(sulforaphane，SF)是一种在十字花科蔬菜中发现的异硫氰酸酯[1]，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用，被认为是对抗炎症反应的有力分子[2]。
肾病综合征主要表现为高脂血症、蛋白尿、水肿和低蛋白血症。多种疾病和因素可导致继发性肾病综合征[3]。炎症是一种重要的病理反应，被认为在肾病综合征的发病机制中发挥主导作用[4]，与肾病综合征密切相关[5]。
核因子NF-E2相关因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是与抗氧化反应元件(antioxidant response elemen，ARE)结合的细胞保护基因的转录激活因子，通过协调炎症细胞的募集和ARE调节基因表达来促进抗炎过程[6]。Nrf2的激活可阻止脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的促炎细胞因子的转录上调[7]。
本文选取SD幼鼠作为实验对象，用多柔比星(doxorubicin，Dox)诱发幼鼠肾病综合征模型，观察SF是否可以通过诱导Nrf2的表达，发挥改善肾病综合征的作用，为临床防治提供新思路。
1.1 仪器
全自动生化分析仪(山东科生物产业有限公司)；
微量移液器(德国Eppendorf公司)；
RM2235徕卡切片机(德国徕卡显微系统贸易公司)；
多功能酶标仪(美国Molecular Device公司)；
CheniDoc XRS化学发光成像分析系统(美国Bio-rad公司)；
蛋白凝胶电泳仪(上海天能科技有限公司)。
1.2 试药
萝卜硫素(质量分数≥99.98%，美国Sigma-Aldrich公司)；
注射用盐酸多柔比星(深圳万乐药业有限公司)；
40 g·L-1多聚甲醛固定液(北京索莱宝生物科技公司)；
尿蛋白、血清白蛋白、白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA试剂盒(美国R&D公司)；
BCA蛋白定量分析试剂盒和RIPA裂解液，均购自碧云天生物技术有限公司)；
5×loading buffer蛋白预混液(武汉三鹰生物技术有限公司)；
一抗：兔抗大鼠Nrf2、β-actin抗体，山羊抗兔辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记二抗，均购自英国Abcam公司。
1.3 实验动物
SPF级雄性SD幼鼠32只，3周龄，体质量(45±1) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2019-0009。
2.1 分组、造模及干预方法
SD幼鼠随机均分为4组，Con组(对照组)、Model组(模型组)、SF组(萝卜硫素组)和SF溶剂组，每组8只。SF组和SF溶剂组分别腹腔注射15 mg·kg-1SF和等体积的注射用生理盐水作为溶媒对照，每天2次，间隔8 h，连续注射3 d。制备Dox诱导的肾病综合征模型则参照之前的造模方法[8]，第4天除Con组外均给予1 mg·mL-1Dox(注射用生理盐水溶解)，尾静脉2次给药(4.0、2.5 mg·kg-1)，2次间隔1周，Con组在相同处理条件下注射等体积的注射用生理盐水。幼鼠出现蛋白尿表明肾功能受到损伤，造模成功。
2.2 取材
第2次给药后3 d收集24 h尿液用于检测尿蛋白的排泄情况。随后用0.1 g·L-1巴比妥钠麻醉幼鼠，腹主动脉取血检测血清白蛋白、IL-18和IL-1β表达水平。取血后取出幼鼠肾脏，组织学固定后，脱水包埋进行HE染色。
2.3 测定
ELISA法对尿蛋白、血清白蛋白水平及促炎因子IL-18和IL-1β血清质量浓度进行定量。用标准BCA方法进行蛋白质测定。根据试剂盒方案制备对照品和样品，并在免疫测定板上孵育30 min。洗孔6次，每孔加入各自对应抗体，继续孵育1 h。再次洗涤板，将包含的兔抗鼠IgG与HRP偶联物加入每个孔中，并将板温育30 min。洗涤板并加入TMB底物用于显色。10 min后停止反应，在450 nm处读取吸光度。标准曲线用于确定样品中的质量浓度。
2.4 肾脏组织HE染色
观察肾脏组织病理。用9 g·L-1注射用氯化钠溶液浸洗左侧肾脏组织，用手术刀切取2 mm厚的组织块，用40 g·L-1多聚甲醛固定液固定，经乙醇梯度脱水置换和二甲苯脱醇处理后石蜡包埋，切片和染色后于光学显微镜下观察肾小球、肾小管及肾间质结构的病理形态学变化结果，每张切片随机选择10个视野进行观察评分。
2.5 Nrf2核蛋白表达量检测
用RIPA裂解液抽提肾脏蛋白，并用BCA法测定蛋白质量浓度，用5×loading buffer样本前预混后进行热变性处理。每孔加入变性后蛋白20 μg，进行SDS-PAGE、转膜、封闭后加入抗体Nrf2，4 ℃过夜孵育，次日TBST漂洗3次，每次8 min，加入对应种属的二抗孵育，显色，并用ChemiDoc XRS化学发光成像分析系统和Image J软件对结果进行灰度分析。
2.6 统计学方法
3.1 各组幼鼠肾组织病理学
Con组可观察到肾小球囊壁基底膜质地均匀，细胞结构、形态排列整齐，见图1A；
Model组和SF溶剂组分别呈现出肾小球球内膜细胞不同程度地紊乱排列、细胞空泡和水肿，见图1B、图1D。同SF溶剂组相比，细胞核排列较整齐，质地较均匀，见图1C。另外，从观察肾脏组织的评分结果可得出，与Con组比较，SF组、SF溶剂组和Model组肾损伤评分显著升高(P<0.05)，其中Model组尤为明显，而SF的预处理可以显著降低肾损伤评分，且高于SF组(P<0.05)；
Model组与SF溶剂组肾脏组织病理学评分差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
注：A.Con组；
B.Model组；
C.SF组；
D.SF溶剂组。
表1 各组幼鼠肾脏组织病理学评分
3.2 各组幼鼠尿蛋白和血清白蛋白比较
尾静脉注射多柔比星后，Model组、SF组及SF溶剂组尿蛋白与血清白蛋白水平显著高于Con组(P<0.05)。Model组24 h尿蛋白和血清白蛋白高于Con组，差异有统计学意义(P<0.05)。SF预处理后可明显降低尿蛋白和血清白蛋白的表达水平，差异均有统计学意义(P<0.05)。但SF溶剂组和Model组尿蛋白及血清白蛋白比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 各组幼鼠尿蛋白和血清白蛋白水平比较
3.3 各组幼鼠血清IL-18和IL-1β比较
Model组和SF溶剂组幼鼠血清IL-18和IL-1β含量高于Con组(P<0.05)；
SF组IL-18和IL-1β含量低于Model组，差异有统计学意义(P<0.05)；
Model组IL-18和IL-1β含量与SF溶剂组比较，差异无统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 各组幼鼠血清IL-18和IL-1β比较
3.4 各组幼鼠肾脏组织Nrf2核蛋白表达比较
与Con组比较，Model组、SF组和SF溶剂组Nrf2核蛋白表达显著上调(P<0.05)，其中SF组上调更显著，为SF溶剂组的2倍(P<0.05)；
Model组与SF溶剂组Nrf2核蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。
本研究结果显示，Model组和SF溶媒组Dox注射后10 d肾损伤组织评分显著升高，同时2组炎性因子IL-18和IL-1β均出现上调。
有报道显示，泛素特异性肽酶10可减轻败血症引起的肾功能障碍，并减少肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激[9]。多柔比星诱导的肾病综合征模型是目前公认的造模方法，其机制可能与氧化应激相关，研究表明，多柔比星造模处理后，模型组幼鼠肾组织中丙二醛含量明显升高，并表现出时间依赖性[10]。
注：A.Con组；
B.Model组；
C.SF组；
D.SF溶剂组。与Con组比较，*P<0.05；
与Model组比较，#P<0.05；
与SF溶剂组比较，%P<0.05。
SF是一种广为人知的炎症抑制剂。有研究显示，SF抑制了LPS激活的N9细胞中一氧化氮、活性氧和促炎细胞因子的产生[11]。SUBEDI L等[12]还观察到，SF抑制了LPS激活的小胶质细胞中一氧化氮的产生和LPS激活的小胶质细胞中的诱导型一氧化氮合酶和COX-2的表达水平。此外，Nrf2和血红素加氧酶-1的激活可增强抗炎细胞因子的产生，尤其是IL-10，以此表明SF的抗炎潜力[13]。本研究结果显示，Model组肾组织Nrf2核蛋白表达水平显著高于Con组，Nrf2核蛋白上调，可能与Dox激活机体炎症有关，因此表现为肾脏损伤。在SF组中，表现出高表达的Nrf2水平和显著降低的肾脏损伤评分，且炎性因子的表达远低于Model组，这表明SF可通过上调Nrf2的表达来减轻Dox诱导肾损伤的加重。
正常生理条件下，Nrf2与其内源性抑制剂Keap1作为一种普遍存在的、进化上保守的细胞内防御机制来对抗炎性反应。炎症反应发生时，Nrf2从Keap1分离并易位到细胞核，并与Maf蛋白异二聚体结合。异源二聚体复合物可识别结合到AREs，启动其下游多个抗氧化基因和解毒酶进行转录翻译，并以此方式对抗氧化应激反应[14]。Nrf2在影响不同系统的炎症性疾病中发挥重要作用，其中包括胃炎、肝损伤、心血管疾病、神经退行性疾病等。Nrf2-/-动物比WT动物表现出更严重的炎症和组织损伤症状。在LPS诱导的肺脓毒症的Nrf2敲除小鼠模型中，NF-κB可调节炎症细胞因子的激活，如COX-2、IL-13、IL-6和TNF-α[15]。因此，认为Nrf2信号通路在炎症性疾病中具有保护作用。
Nrf2/ARE信号通路在炎症性疾病中发挥了重要保护作用，Nrf2可上调SF表达，是Nrf2基因最重要的激活剂[16]。本研究结果发现，SF预处理后Nrf2表达水平显著提高，肾脏形态学上观察有明显的改善作用，并伴随尿蛋白、血清白蛋白和促炎因子的下调，表明了从某种程度上SF可诱导上调Nrf2的表达从而发挥保护肾功能的作用。本研究从幼鼠肾病综合征模型入手，探索了SF在该疾病中的干预作用，说明了其在Nrf2/ARE通路中扮演的基本角色。在随后的研究中，将会继续在细胞水平上着重探讨其分子通路的机制和蛋白相互作用。
综上所述，SF可缓解Dox诱导的幼鼠肾病综合征功能损伤和炎症状态，可能是通过激活Nrf2/ARE来发挥作用的。
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