高薇薇， 王 枭， 关 鹏(综述)， 高万朋(审校)
脓毒症是指因感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1]。而肠道被描述为脓毒症和器官衰竭的“发动机”[2]。虽然脓毒症的发病机制复杂，但许多研究表明肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)凋亡增加由促炎细胞因子和干扰素[3]的分泌增强所致，并最终导致肠屏障功能障碍，造成肠道菌群失调可引起肠道黏膜屏障受损，内毒素及致病菌可入血，引起机体产生炎性介质释放诱发人体一系列炎症和免疫反应[4]。近年来，研究发现了一种新的胞质DNA传感器环鸟苷酸腺苷酸合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthetase,cGAS)以及干扰素基因的刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)。越来越多的研究表明，该信号通路的激活对于宿主抵御病毒、细菌感染以及癌症至关重要，特别是与肠道稳态有关，过度激活可以导致肠屏障功能障碍[5]。因此，深入了解脓毒症发生时cGAS-STING信号通路激活及作用机制，对于改善脓毒症肠屏障功能障碍具有重要意义。本文就cGAS-STING信号通路的激活、cGAS-STING信号通路与脓毒症肠道炎症反应和cGAS-STING信号通路对肠屏障功能的影响作一综述。
STING是一种参与对细菌产物先天免疫应答的适配器蛋白，存在于各种细胞类型中的内质网中，包括上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞。在脓毒症期间，病原体相关分子模式蛋白(pathogen-associated molecular pattern molecules,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)表达在入侵的组织器官上，并且以受体识别模式(pattern recognition receptors,PRRs)的方式被肠道识别并激活STING信号，将微生物的胞质传感与宿主细胞的效应功能联系起来。除了微生物感应之外，STING也能被宿主自身脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)激活[6]。刺激STING信号环二核苷酸(cyclic dinucleotides,CDNs)是重要的细菌代谢产物，而DNA存在于大多数微生物中，在核DNA(nuclear DNA,nDNA)损伤或线粒体断裂后，nDNA或线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)被释放到细胞质中，这两种微生物被cGAS及其第二信使环鸟苷酸腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)识别[7-8]。cGAMP可通过体积调节的阴离子通道或缝隙连接易位到邻近细胞，导致邻近细胞的STING激活[9]。在与cGAMP结合后，STING通过高尔基体和内质网高尔基中间室运输，最终转移到核周区域的囊泡中。激活的STING随后招募TANK结合激酶1(TANK- binding kinase 1,TBK1)，并磷酸化干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)。这些转录因子能够从细胞质易位到细胞核，诱导先天免疫基因转录，有助于最终产生Ⅰ型干扰素(interferon-Ⅰ,IFN-Ⅰ)和其他炎性细胞因子，如白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。cGAS-STING介导的炎症、IFN-Ⅰ反应和细胞死亡可能导致或加重脓毒症和脓毒性休克的发病[10]。
脓毒症的急性期表现为对感染的炎症反应以及过度释放促炎介质。因此，抑制免疫反应的关键炎症调节因子可能有助于治疗脓毒症。cGAS-STING途径的不当激活或过度激活可产生大量IFN-Ⅰ，释放至细胞外的IFN-Ⅰ能够以自分泌或旁分泌的方式，结合自身或者周围细胞上的IFN-Ⅰ受体(IFN α receptor,IFNAR)，进一步激活其下游JAK-STAT通路，诱导数百个干扰素刺激基因(IFN- stimulated genes,ISGs)的表达，导致自身炎症和自身免疫性疾病[11-12]。Aden等[13]表明，IECs中激活的STING信号可诱导强烈的TNF-α和ISGs反应，从而导致过度的回肠炎症和广泛的上皮细胞坏死。有研究认为，由cGAS触发的IFN-Ⅰ也可以通过干扰素受体信号再次诱导cGAS的表达，IFN-Ⅰ过度激活导致免疫系统紊乱[14]。而STING激动剂可以激活STING，加重了脓毒症大鼠的肠黏膜损伤，证明了STING信号的激活加重了脓毒症肠道损伤和肠道屏障紊乱[12]。此外，研究证实NF-κB具有调控复杂的炎症细胞因子网络的重要作用，NF-κB由STING激活后，进入细胞核，调控TNF-α和IL-1等炎症介质的基因表达，进一步作用于巨噬细胞等产生大量IL-6、IL-8等继发性细胞因子和介质。与此同时，STING可以诱发释放IL-10等抗炎细胞因子[15]，进一步激活NF-κB，从而形成正反馈的级联放大效应，产生过度的炎症反应，加重组织和细胞的损害。因此，需要表达免疫负调控因子准确、适时地调整胞内信号通路的激活，避免发生过强的免疫反应，从而保证机体免疫平衡。对cGAS-STING通路的负向调控还可减少其他炎症因子如IL-6、TNF-α表达，减轻细胞因子风暴及组织损伤程度[16]，这为治疗脓毒症肠道炎症损伤提供了新的思路。
3.1cGAS-STING信号通路对肠道通透性的影响 肠道的内部是由IECs构成，IECs可以起到隔绝内部组织与外界接触的作用，并且可以吸收食物中的营养物质，与肠道内的微生物接触，并且清除病原体、内毒素和抗原物质。当这个过程受到干扰，肠道的稳态被破坏继而引发疾病。相邻的IECs通过紧密连接(tight junctions,TJs)衔接，形成细胞旁密封以防止亲水分子的混合物进入并能够通过PRRs的方式识别细菌，通过分泌趋化因子将这些信息传递给免疫系统的细胞[17]。TJs是由完整的膜蛋白，包括闭锁蛋白(claudins)、胞质附着蛋白(occludin)、连接黏附分子(junctional adhesion molecules,JAMs)和闭锁小带蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)组成的多蛋白复合物连接到肌动蛋白细胞骨架。TJs在调节上皮细胞通透性中发挥着重要作用。STING的激活启动IRF3和NF-κB，导致IFN-Ⅰ和炎症细胞因子的表达增强[11]。其中TNF-α是脓毒症最重要的炎症因子，而IECs是其攻击的主要靶细胞。TNF-α通过与IECs上表达的TNF受体2结合，诱导炎症过程中的肌球轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)上调，可以使肌球蛋白铅磷酸化导致细胞骨架收缩和中断，上调ZO-1、occludin受阻，并且导致黏液层的破坏，TJs改变，使得上皮通透性增加，导致细菌易位[18]。在Hu等[12]的研究中，脓毒症大鼠模型，STING敲除组相对于脓毒症组的ZO-1和claudins水平显著升高，并且发现了TJs改善，证明了cGAS-STING信号可以造成TJs改变，导致肠道通透性增加，最终造成肠道菌群易位。
3.2细胞死亡 在脓毒症急性期，不受控制的程序性细胞死亡导致多器官衰竭或免疫抑制的发展[19]。细胞死亡(包括凋亡、焦亡和坏死性凋亡)，是调节细菌感染的脓毒症反应的关键。细胞死亡是组织发育和平衡的关键过程，以消除多余的、损伤的或老化的细胞，是急性或慢性损伤后稳态重建的关键，限制炎症刺激的传播，以防止组织功能的丧失，这对胃肠道特别重要。因此，上皮细胞的更新和细胞死亡需要被严格调控，不适当的细胞死亡反应会导致疾病发展。这种稳态功能反映了受损或衰老细胞的消除以及死亡细胞暴露或释放激活免疫反应的DAMPs的能力[20]。有研究表明，STING不仅介导细胞死亡，而且在识别和放大死亡细胞诱导的免疫反应中发挥作用[21]。
3.2.1 凋亡 细胞凋亡被定义为依赖半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活的程序性死亡过程。IECs凋亡被认为是肠道屏障功能障碍的关键加速剂之一。最近的研究评估了STING信号通路在凋亡激活中的新作用。Diner等[22]证明cGAS依赖的免疫信号进一步诱导caspase-3的激活，通过激活STING-TBK1-IRF3通路导致细胞凋亡。mtDNA尤其可能通过STING信号在介导细胞凋亡中发挥关键作用。mtDNA的释放，从而激活cGAS-STING通路，促进IFNs的产生，继而介导细胞凋亡[23]。在脓毒症小鼠模型中，mtDNA水平的升高可诱导肠上皮细胞中STING依赖性的凋亡[12]。STING介导的细胞凋亡的机制主要与内质网应激后产生的标志物以及内质网钙信号通路增强了细胞对凋亡的敏感性相关[24]。综上，STING1-IRF3通路既参与凋亡来源的免疫反应，也参与凋亡诱导。该通路可被caspase调控，而STING、内质网应激与凋亡之间的相互作用和反馈机制肯定是复杂的。
3.2.2 焦亡 焦亡是一种主要依赖caspase-11激活的程序性细胞死亡类型[25]，在炎症和免疫中起核心作用。过度激活的焦亡可能导致脓毒症、脓毒性休克以及器官功能障碍。免疫细胞内的炎症小体为促炎因子(IL-1β和IL-18)的成熟和产生提供了分子平台。特别是炎症小体招募caspase-1的过程有助于caspase-1的激活以及炎症细胞因子的产生和焦亡的启动[26]。在其机制方面，可能有3种途径参与了STING依赖的炎症小体的激活和焦亡：(1)炎症小体的转录上调需要STING介导的IRF3；
(2)STING可以直接结合并促进炎症小体在内质网中的定位，从而抑制炎症小体的泛素降解[27]；
(3)在对人髓系细胞中胞质DNA的反应中，cGAS-STING通路通过STING介导的溶酶体细胞死亡激活钾外排介导的炎症小体。这些表明cGAS-STING通路触发与细胞质DNA相关的焦亡和促炎反应。
3.2.3 坏死性凋亡 坏死性凋亡是一种受调控的程序性细胞死亡机制，由多种死亡受体、模式识别受体和细胞因子共同驱动，在许多炎症和疾病状态中发挥重要作用。这种凋亡最初被报道与受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase,RIPK)1和RIPK3有关。刺激后，RIPK1和RIPK3被坏死体复合体中的自身磷酸化激活。随后，混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)被招募并被RIPK3磷酸化，导致MLKL寡聚。寡聚MLKL转运到细胞膜上，促进质膜通透性，从而引发坏死性凋亡。RIPK3和MLKL目前被认为是介导这种形式死亡的主要靶点，表明STING-IRF3-RIPK3-MLKL通路通过磷酸化机制驱动坏死性凋亡。此外，TNF-α的产生也参与了STING介导的坏死。Li等[16]的研究发现IFN-Ⅰ控制细胞凋亡、坏死和坏死性凋亡信号的关键介质的转录。Zhang等[5]的研究揭示mtDNA介导的STING信号通过IFN-Ⅰ和TNF-α信号的协同作用触发肠道细胞坏死性凋亡。cGAS-STING的激活可导致RIPK3介导的坏死性凋亡，这需要STING依赖的IFN-Ⅰ和TNF-α的产生。总之，这些数据表明，STING信号通路通过至少两种机制触发坏死，即诱导MLKL表达或MLKL磷酸化。此外，坏死性凋亡诱导的RIPK3释放可能作为肠道损伤的生物标志物[28]。
3.3自噬机制 自噬是抵御微生物侵袭的天然免疫防御机制，可通过抑制促炎复合物或增强受损细胞器的清除来保护IECs免受过度的炎症刺激[29]，在细胞和组织的动态平衡中起重要作用，是一种有益的生命过程。自噬异常可导致肠道内稳态失衡和慢性肠道炎性疾病的发生。有研究表明，STING激活伴随着明显促进的脂质过氧化损伤，这也表明在这一时期发生了自噬的抑制[30]。随着脓毒症的发展，自噬活性逐渐下降[31]。因此，STING激活介导的自噬变化是临床预后不良的关键转折点。STING激活以IFN-Ⅰ依赖的方式干扰溶酶体酸化，而不影响自噬小体的生物发生或融合。然而，过度STING激活引起的副作用的机制仍有待进一步研究。循环中的mtDNA被巨噬细胞的STING途径识别，导致溶酶体酸化功能障碍，并阻碍自噬是脓毒症中远处器官损伤的另一种机制，与致病菌引起的感染性损伤同时发生[32]。beclin-1自噬蛋白与cGAS的直接相互作用不仅抑制STING信号，减少胞质DNA刺激下的IFNs分泌，而且促进自噬介导的胞质DNA降解，以防止cGAS过度激活。同样，参与自噬机制的关键基因可以抑制STING-TBK1-IRF3通路，有效抑制持续免疫反应和过度炎症[11]。这些发现为通过诱导自噬或抑制STING途径减轻脓毒症肠道损伤，改善肠屏障功能提供了新的见解。
3.4NLRP3炎症小体 NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体是先天免疫系统的重要中介途径。NLRP3炎症小体成分主要包括3个成员：凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、NLRP3和凋亡细胞蛋白酶原(procaspase)-1[33]。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是一种内源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂清除蛋白，当细胞受到PAMPs和DAMPs诱导的ROS挑战时，它将与TXNIP-硫氧还蛋白(TXNIP-thioredoxin,Trx)复合物分离，并与NLRP3结合。随后，NLRP3/TXNIP复合物招募其他2个成员(ASC和procaspase-1)，形成NLRP3炎症小体，促进caspase-1的激活，IL-18和IL-1β的产生，以及炎症和细胞焦亡的启动[34]。然而，STING在脓毒症肠屏障功能障碍中的作用及其对NLRP3的潜在调控作用至今尚未得到很好的研究。NLRP3的表达可以通过STING-IRF3依赖的方式被激活，Li等[35]研究了STING通过激活NLRP3信号通路导致脂多糖诱导的组织功能障碍、炎症、凋亡和焦亡。此外，抑制cGAS也阻断了STING和NLRP3炎症小体的激活。脓毒症状态下，机体NLRP3炎症小体及下游分子高表达，通过增加促炎因子的成熟释放及诱导凋亡反应，参与调控脓毒症免疫反应，与器官功能障碍及不良预后密切相关。
cGAS-STING信号通路在肠道稳态中具有重要作用。在脓毒症中，CDNs和mtDNA激活cGAS-STING通路诱导的过度炎症反应，造成TJs破坏、IECs死亡、阻断自噬以及诱导炎症小体形成，导致肠屏障完整性损伤，肠道通透性增加以及菌群易位，最终造成肠屏障功能障碍。这些过程不仅放大了STING信号通路的激活，还可以诱导严重的全身炎症反应，两者都可能导致细胞因子风暴和加重脓毒症多脏器功能障碍。因此，阻断cGAS-STING信号通路可能是调节脓毒症过度炎症反应和肠道屏障功能障碍的潜在治疗方法和作用靶点。这可能为脓毒症的发病机制及治疗提供新的思路。
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