陈 瑶，邵宗泽，邱冬华，杨 渐，曾 湘*
(1.自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 361005；
2.中国地质大学(武汉)、生物地质与环境地质国家重点实验室，湖北 武汉 430074)
已有研究表明，当培养体系中存在氧化还原电势相对较高的铁锰氧化物时，微生物对有机碳源的利用率会提高，推测其主要机制为铁锰氧化物作为电子受体，为微生物获得更多能量；
铁锰氧化物亦可作为电子传递体，加速微生物胞外电子传递[4]。例如，在厚壁菌门中，巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)、贝氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、发酵厌氧杆菌(Anoxybacterfermentans)的培养基中添加无定形水铁矿或磁铁矿后，葡萄糖的消耗量显著提高，并使得H2、CO2、乙酸和丁酸等代谢产物产量明显增加[5-9]。铁氧化物是深海热液环境中丰度较高的矿物，但是铁还原过程对热液区典型嗜热细菌(热球菌目)的发酵代谢过程的影响及机制却鲜有报道。
本研究以从印度洋西北部嘉士伯脊深海热液硫化物中分离到的栖热腔菌ThermosiphoferrireducensJL129W03T为实验对象，添加四方纤铁矿(β-FeOOH)后对不同培养时间下的细菌量和发酵代谢产物进行了定量分析，并结合该菌株的基因组数据，分析了其代谢途径。本研究不仅有助于了解深海热液环境下，菌株JL129W03对有机碳的利用过程和影响因素，也为该菌株进一步开发获取及应用生物质能源(H2、乙醇等)奠定基础。
1.1菌株
铁还原栖热腔菌ThermosiphoferrireducensJL129W03T,由本课题组前期分离纯化自西北印度洋嘉士伯脊(6.4°N，60.5°E，2 919 m)深海热液硫化物，保存于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC 1A14213T)和韩国典型菌种保藏中心(KCTC 15905T)。
1.2 培养基
人工海水：23 g/L NaCl,5.0 g/L MgCl2·6H2O,0.15 g/L CaCl2,0.7 g/L KCl,6.05 g/L (NH4)2SO4,0.05 g/L NaBr,0.01 g/L SrCl2·6H2O；
YTG培养基：23 g/L酵母提取物,1 g/L蛋白胨,2.5 g/L 葡萄糖,30 g/L海盐(Sigma),0.4 g/L哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)，0.001 g刃天青；
FRP培养基:1 L人工海水中加入10 g细菌学蛋白胨，6.05 g PIPES，0.001 g刃天青；
FRPFO培养基:人工海水中加入10 g/L细菌学蛋白胨,0.5 g/L四方纤铁矿(β-FeOOH;实验室配制),6.05 g/L PIPES，0.001 g/L刃天青；
所有培养基的pH调节至 7.3。通纯氮气除氧后，于121 ℃，灭菌20 min[10]。培养前，添加还原剂0.5 g/L半胱氨酸盐酸盐。四方纤铁矿(β-FeOOH):将0.5 mol/L FeCl3溶液在90 ℃下加热16 h，所得沉淀物用蒸馏水彻底清洗后中温干燥成粉末状态保存[11]。
1.3 细菌计数及代谢产物分析
菌株JL129W03按2%比例接种于FRP及FRPFO培养基中，70 ℃厌氧培养，取样时间为0、12、36、60、96 h。用注射器吸取厌氧管中的菌液，滴加到血球计数板上，荧光染色(LIVE/DEAD©BacLight Bacterial Viability Kits，Invitrogen，USA)后，在显微镜下观察，计算细胞个数。
乳酸、乙醇、乙酸、丁酸的测定：将培养液用稀H2SO4稀释至终浓度5 mmol/L，过滤后的滤液用Waters高效液相色谱仪(e2695，Alliance)进行定量分析。高效液相色谱条件：色谱柱 (Aminex HPx87)，进样10 μL，流动相为 5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱温30 ℃。
CO2、H2的测定：抽取血清瓶中的顶空气体1 mL，加滤头过滤后进样，用气相色谱仪(Thermo Trace GC ULTRA)进行定量分析。气相色谱仪条件：TCD检测器(Porapark Q 2 m×1/8英寸)；
进样口60 ℃，柱温箱50 ℃，检测器120 ℃，恒温模式，灯丝200 ℃，载气He，流速30 mL/min。检测H2时载气为N2，检测CO2时载气为He，流速30 mL/min。
1.4 还原糖含量测定
将FRP及FRPFO培养基中的细菌学蛋白胨替换为1%的可溶性淀粉或者1%的羧甲基纤维素后，接种2%的细菌，培养24 h(指数生长期后期)后取样，测定培养基中还原糖含量。
葡萄糖标准曲线绘制：配置浓度为0.007 8、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL的葡萄糖标准液，取75 μL葡萄糖标准溶液，加入150 μL DNS试剂，加入75 μL纯水混匀后，沸水浴10 min后冷却至室温，OD540处读取吸光度值。得到葡萄糖标准曲线方程为：y=1.497 2x+0.089 4(R2=0.998 9)。其中y为吸光度，x为葡萄糖浓度(mg/mL)。
1.5 基因组分析
细菌培养至指数后期或稳定期，提取细菌DNA[12]，利用Illumina-Hiseq平台(美吉生物)测定细菌的全基因组序列(GenBank/EMBL/DDBJ登录号为CP071446)。通过COG、KEGG、GO、Pfam等数据库[13-16]对基因进行功能注释。同时，利用NCBI 细菌基因组注释工具PGAP对基因组进行功能基因注释[17]，利用UniProt网站对氢酶进行分析。
2.1 添加β-FeOOH对菌株JL129W03细胞生长的影响
在添加了β -FeOOH的FRPFO培养物中，最大细胞生长量可达2.19×108cells/mL，明显高于不添加β-FeOOH的FRP培养物(最大细胞生长量仅为3.17×107cells/mL，图1)。添加β-FeOOH的FRPFO培养物中，此结果说明铁还原过程对菌株JL129W03的细胞生长有显著的促进作用。
2.2 添加β-FeOOH对菌株JL129W03发酵代谢产物的影响
菌株JL129W03利用蛋白胨进行发酵代谢的主要代谢产物为乙醇、乙酸、乳酸、丁酸、H2和CO2(图2)。其中乳酸和丁酸在指数生长期初期(12 h)开始大量积累，乙醇在衰亡期大量积累，H2和CO2在指数生长末期及稳定期大量积累。由图2可知，与未添加β-FeOOH的对照组相比，添加β-FeOOH后的菌株JL129W03产乙醇的最大产量(57.97 mg/L)明显高于FRP培养物[32.88 mg/L，图2(a)]；
乳酸的最大产量(99.83 mg/L)低于FRP培养物[130.96 mg/L，图2(c)]；
丁酸的最终产量(32.16 mg/L)显著低于FRP培养物[119.25 mg/L,图2(d)]；
H2的最大产量(14.12 mmol/L)略低于FRP培养物[14.60 mmol/L,图2(e)]。而β-FeOOH的添加对乙酸[FRPFO:204.22 mg/L；
FRP:203.09 mg/L,图2(b)]和CO2[FRPFO:1.18 mmol/L；
FRP:1.15 mmol/L，图2(f)]的代谢产量几乎无影响。
图1 添加/不添加β-FeOOH时菌株 Thermosipho ferrireducens JL129W03T的细胞生长曲线Fig.1 Growth curves of Thermosipho ferrireducens JL129W03T in FRPFO medium with β-FeOOH or FRP medium without β-FeOOH
图2 不同培养时间Thermosipho ferrireducens JL129W03T的发酵代谢产物Fig.2 Product of fermentation metabolites in Thermosipho ferrireducens JL129W03T in different culture time
2.3 添加β-FeOOH对菌株JL129W03利用有机物的影响
还原糖是纤维素和淀粉水解的产物，本研究通过检测还原糖来分析菌株水解淀粉和纤维素的能力。结果表明，在以1%羧甲基纤维素或者1%可溶性淀粉为唯一碳源的FRPFO培养物中的还原糖含量为0.16 mg/L和0.83 mg/L，高于不添加β-FeOOH的FRP培养物中的还原糖含量(0.08 mg/L和0.62 mg/L)。由此可见，加入β-FeOOH后，能促进菌株JL129W03水解可溶性淀粉以及纤维素，提高对有机底物利用率。
2.4 基于基因组的发酵代谢途径分析和水解酶分析
通过基因组信息分析，菌株JL129W03具有完整的糖酵解途径，通过糖酵解产生ATP、NADH和丙酮酸，丙酮酸继续被转化为乙醇、乙酸、乳酸、丁酸、H2和CO2等代谢产物(图3)。具体的途径详述如下。
图3 Thermosipho ferrireducens JL129W03T碳代谢途径(包括发酵途径和产氢途径)Fig.3 Thermosipho ferrireducens JL129W03T carbon metabolism pathways including fermentation and hydrogen productionG-6-P为6-磷酸葡萄糖,F-6-P为6-磷酸果糖,F-1,6-P为1，6-二磷酸果糖,G-A-P为磷酸甘油醛,B-P-G为2,3-二磷酸甘油酸,GLK为葡萄糖激酶,G6PL为葡萄糖-6-磷酸异构酶,PFK为6-磷酸果糖激酶,FDA为果糖-1,6-二磷酸醛缩酶,GAP为甘油醛-3-磷酸脱氢酶,TPI为磷酸丙糖异构酶,PGM为葡萄糖磷酸变位酶,NSE为烯醇化酶,PK为丙酮酸激酶,LD为L-乳酸脱氢酶,PFL为丙酮酸甲酸裂解酶,ADH为乙醇脱氢酶,AHP为磷酸转乙酰酶,ACK为乙酸激酶,THL为硫解酶,PTB为丁酰磷酸转移酶,BK为丁酸激酶。
2.4.1 产乙醇途径 菌株JL129W03糖酵解产生丙酮酸后，通过丙酮酸合成酶、铁氧还蛋白酶、丙酮酸氧化还原酶将丙酮酸脱羧生成的乙醛，经过NADPH依赖型乙醇脱氢酶将产物转化为乙醇[18]。菌株JL129W03中的 gene1722-1725蛋白与海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的TM0015-0018同系物[19](即丙酮酸合成酶、铁氧还蛋白酶、丙酮酸氧化还原酶)相似，其能代替丙酮酸脱羧酶的作用，此反应已经在Pyrococcusfuriosus的体外实验中得到证实[20]。
2.4.2 产乙酸途径 菌株JL129W03糖酵解产生丙酮酸后，通过丙酮酸甲酸裂解酶形成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A在磷酸乙酰转移酶和乙酸盐激酶等酶的作用下生成乙酸。
2.4.3 产乳酸途径 菌株JL129W03糖酵解产生丙酮酸后，在L-乳酸脱氢酶的作用下生成L-乳酸。
2.4.4 产丁酸途径 基因组中存在形成丁酸的关键酶—丁酰磷酸转移酶和丁酸激酶，但是缺少从乙酰CoA 到丁酰CoA的中心途径的关键酶基因—二羟基丁酸辅酶A脱氢酶和丁酸辅酶A脱氢酶[21]，推测可能存在具有相同功能的其他酶基因。
2.4.5 产氢途径 丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)产生还原铁氧还蛋白(Fd)，被[Fe-Fe]氢酶(表1)重新氧化，并生成H2；
同时利用NADH中的还原力将氧化态铁氧化还原蛋白还原。
利用UniProt网站分析发现，菌株JL129W03基因组中主要含有3个编码氢酶的基因，其类型主要为[Fe-Fe]氢酶，与T.maritima等热袍菌属菌株均具有较高的蛋白同源性。与T.maritima的氢酶相比，菌株JL129W03的Catalytic HydA中缺少一个[2Fe-2S] 簇，Diaphorase HydB 中缺少两个[4Fe-4S]簇(表1，图3、4)。
表1 Thermosipho ferrireducens JL129W03T的氢酶分析Tab.1 Hydrogenase analysis of Thermosipho ferrireducens JL129W03T
图4 菌株JL129W03和Thermotoga maritima的氢化酶操纵子元件比较Fig.4 Hydrogenase operons in Thermosipho ferrireducens JL129W03 and Thermotoga maritima绿色表示催化位点；
氧化还原活性中心用圆圈表示，其中红色表示[4Fe-4S]簇，黄色表示[2Fe-2S]簇。
ThermosiphoferrireducensJL129W03T基因组中，与糖类代谢有关的编码基因共计115个，占6.3%左右，含有编码半乳聚糖(galactan)的α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase)、属于糖苷水解酶13家族的α-淀粉胞外酶AmyA和属于纤维素酶系的内切葡聚糖酶等相关基因。与海栖热袍菌(Thermotogamaritima)[22]相比，缺少木聚糖酶、海藻多糖水解酶和果胶水解酶等。
2.5 讨论
前人研究认为，发酵型铁还原菌不能从铁还原过程中获得能量，三价铁化合物主要是作为电子的间接接受体。Lovley等(1988)的研究结果表明，添加Fe(III)后，变形菌门地杆菌GeobactermetallireducensGS-15的细胞产量没有增加[23]。但也有其他研究表明，铁还原过程不仅能促进细胞的生长，也促进了发酵代谢产物如H2、乙酸、丁酸和CO2等的积累，厚壁菌门微生物在铁还原过程中获得了能量[9]。本研究结果表明，铁氧化物的添加增加了热袍菌门菌株JL129W03的最大细胞生长量，这说明Fe(III)还原可以为部分细菌生长提供能量。Fe(III)还原过程还促进了乙醇、乙酸的产生，但丁酸的产量相对降低。我们推测，由于产乙酸途径相比产丁酸代谢途径可以产生更多的电子。类似现象在梭菌中也有发现[24]，例如在菌株ClostridiumbifermentansEZ-1的培养中，磁铁矿和水铁矿的添加加强了菌株产乙酸代谢途径，同时减弱了菌株的产丁酸能力，产生了更多的电子用来满足Fe(Ⅲ)氧化物还原对电子输出的需求[25]。同时，由于发酵产生的NADPH，更利于 NADPH 依赖型乙醇脱氢酶(NADPH-dependent primary alcohol dehydrogenase)的活性，利于乙醇的增加[18-19]。在本研究中，铁氧化物的添加，促进了菌株JL129W03的发酵代谢，产生了更多的NADPH和铁还原蛋白，促进了NADPH依赖型乙醇脱氢酶的活性，因此增加了乙醇的产生。
铁还原栖热腔菌ThermosiphoferrireducensJL129W03T与海栖热袍菌碳代谢中心途径和主要发酵途径相似[26]，菌株JL129W03的产氢途径推测是[Fe-Fe]氢酶将还原型的铁氧还蛋白的电子传递到质子产生H2或者它同时利用NADH中的还原力产氢，通过与其他发酵途径竞争NADH达到高产H2的效果。Schröder等(1994)发现，在热袍菌门中，Thermotoganeapolitana、Petrotogamiotherma、Thermosiphoafricanus、Thermotogaelfii和Fervidobacteriumpennavorans的H2最大产量分别约为25%～30%、11%、13%、22%和18%[1]。T.maritima的H2最大产量约为7 mmol/L[27]。本研究中，菌株JL129W03的最大H2产量分别为31.7% (FRPFO:14.12 mmol/L)和32.8% (FRP:14.60 mmol/L)，其H2产量均高于目前所报道的同门其他菌株，表明菌株JL129W03在产氢方面具有较大的应用前景。Thermotogahypogea能代谢产生1 mmol/L乙醇[28]；
Fervidobacteriumnodosum[29]和Fervidobacteriumgondwanense[30]分别能代谢产生2.3 mmol/L和2 mmol/L的乙醇。本研究中，菌株JL129W03的乙醇产量分别为1.24 mmol/L (FRPFO:57.97 mg/L)和0.71 mmol/L (FRP:32.88 mg/L)，其乙醇产量与目前所发表的菌株产量相似；
Fe(Ⅲ)氧化物的添加可以明显提高其H2和乙醇的产量，为其潜在的应用奠定了基础。
本研究利用细胞计数、液相色谱及气相色谱对添加四方纤铁矿(β-FeOOH)后，不同培养时间下菌株JL129W03的细胞生长情况和代谢产物进行了定量分析，并利用基因组信息对其碳代谢中心途径和主要发酵途径进行分析。结果表明，菌株JL129W03主要发酵代谢产物为乙醇、乙酸、乳酸、丁酸、H2和CO2。菌株JL129W03经糖酵解产生丙酮酸后，丙酮酸脱羧后生成乙醛再经过NADPH依赖型乙醇脱氢酶将产物转化为乙醇；
通过铁氧还蛋白氧化还原酶、磷酸乙酰转移酶和乙酸盐激酶生成乙酸；
通过乳酸脱氢酶形成乳酸；
[Fe-Fe]型氢酶将还原铁氧还蛋白重新氧化生成H2。β-FeOOH的存在导致了菌株JL129W03更多的电子需求，能促进细胞的生长及底物的利用率，促进乙醇产生(累积产量提高76%)，抑制丁酸的产生(累积产量降低73%)；
对羧甲基纤维和可溶性淀粉的利用率分别提高100%和34%；
产生了更多的NADPH，促进了NADPH依赖型乙醇脱氢酶的活性，从而增加了乙醇的产生。本研究对了解铁还原栖热腔菌ThermosiphoferrireducensJL129W03T的生理代谢特点和进一步应用开发清洁能源(H2、乙醇等)奠定了基础。
致谢：感谢中国大洋38航次及“向阳红”9号、“蛟龙号”全体科考队员协助获取深海样品。
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