薛 蕾 任文平 吴晓华
(包头市第四医院肾内科，内蒙古包头市 014030)
肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是临床上常见的肾小球疾病，在各个年龄段均有发生，其典型症状表现为“三多一少”，即大量蛋白尿、高脂血症、高度水肿、低蛋白血症，以发病率高、病情易反复、预后较差为主要特征，且易发生血栓、急性肾衰竭、心血管疾病等并发症，严重威胁患者的生命安全[1]。目前，临床上通常采用糖皮质激素、细胞毒性药物或免疫抑制剂治疗NS，以达到抑制炎症渗出、减少蛋白尿的目的，但效果并不理想，且易增加对激素的耐药性、出现较严重副作用[2]，不适合长期使用。虎杖苷是中药虎杖的主要有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗血小板聚集、改善微循环等生物学作用[3]。有研究表明，虎杖苷对脓毒症诱导的急性肾损伤大鼠具有较好的治疗作用[4]。然而，目前有关虎杖苷用于治疗NS的报告较少，且缺乏相应的机制研究。本研究通过建立阿霉素肾病大鼠模型，观察虎杖苷对阿霉素肾病模型大鼠肾脏及心脏的保护作用，并探讨相关机制。
1.1 实验动物 40只无特定病原体级SD雄性大鼠，6周龄，体质量(200±20)g，购自北京科宇动物养殖中心[生产许可为SCXK(京)2018-0010]。在恒温恒湿环境内适应性喂养，环境温度为20 ℃～25 ℃、湿度为50%～70%，普通饲料喂养，大鼠自由进食、饮水。
1.2 药物、主要试剂、仪器 虎杖苷(纯度为98%，成都植标化纯生物技术有限公司，批号：27208-80-6)，注射用盐酸多柔比星(浙江海正药业股份有限公司，国药准字H33021981，规格：50 mg)，蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)/真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)/CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)通路激活剂CCT020312(上海陶术生物科技有限公司，批号：324759-76-4)，双缩脲蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：PC0040)，RIPA裂解液(上海亚培生物科技有限公司，批号：P0013C)，二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：C503021-0500]，兔抗大鼠PERK一抗、兔抗大鼠磷酸化PERK(phosphorylated PERK，p-PERK)一抗、兔抗大鼠eIF2α一抗、兔抗大鼠磷酸化eIF2α(phosphorylated eIF2α，p-eIF2α)一抗、兔抗大鼠CHOP一抗、GAPDH抗体(Abcam公司，批号：ab229912、ab192591、ab169528、ab32157、ab11419、ab9485)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(北京博尔西科技有限公司，批号：BHR101)，ECL发光液(上海博耀生物科技有限公司，批号：RS0003)。VEVO3100小动物超声成像系统(VisualSonics公司)，BS-240全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，SZX10显微镜(OLYMPUS公司)，GelSMART凝胶分析仪[大龙兴创实验仪器(北京)股份公司]。
1.3 构建阿霉素肾病大鼠模型 大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法选取30只大鼠，经其尾静脉注射0.2%注射用盐酸多柔比星溶液6 mg/kg，给予其余10只大鼠尾静脉注射同体积生理盐水。然后在温度20 ℃～25 ℃、湿度50%～70%的环境中饲养，大鼠自由进食、饮水。7 d后收集大鼠24 h尿液，若24 h尿蛋白水平>20 mg，则视为建模成功[5]。本研究的30只大鼠全部建模成功。
1.4 分组及干预 参照文献[6-7]的方法进行分组与干预。采用随机数字表法将建模成功的30只大鼠分为模型组、虎杖苷组、联合组，各10只；
将同期注射生理盐水的10只大鼠作为对照组。确认造模成功后次日，给予联合组大鼠灌胃虎杖苷溶液(将25 mg虎杖苷溶解于0.25 mL生理盐水中，配制成浓度为100 mg/mL的溶液)100 mg/kg，2 h后腹腔注射CCT020312溶液[将50 mg的CCT020312溶解于0.25 mL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，配制成浓度为200 mg/mL的溶液]40 mg/kg；
给予虎杖苷组大鼠灌胃虎杖苷溶液100 mg/kg，2 h后腹腔注射DMSO 0.2 mL/kg；
给予对照组、模型组大鼠灌胃生理盐水1 mL/kg，2 h后腹腔注射DMSO 0.2 mL/kg。均1次/d，共干预7周。干预期间的饲养环境为温度20 ℃～25 ℃、湿度50%～70%，大鼠自由进食、饮水。
1.5 心脏功能检测 末次干预结束后4 h，采用心脏超声检测各组大鼠的心脏功能经腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠后，将大鼠仰卧固定于工作台上，剔除胸毛，将心脏超声探头置于左胸向右上方指向，设置采集深度为16 mm，获取左室长轴切面及乳头肌短轴切面，探头下移并顺时针转动，获取心尖四腔、五腔、二腔切面，测量左室等容舒张时间(isovolumetric relaxation time， IVRT)，同时记录运动频谱，测量二尖瓣舒张早期峰值速度(early peak diastolic velocity， E)与舒张晚期峰值速度(late peak diastolic velocity， A)，记录3个位点取均值。测量5个心动周期，取均值。
1.6 肾功能指标检测 超声检测结束后次日，收集大鼠24 h尿液置于离心管内，2 000 r/min离心8 min(离心半径10 cm)，取上清液，采用双缩脲比色法检测24 h尿蛋白水平。取尿标本后，经腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，采集腹主动脉血 3 mL，采用全自动生化分析仪检测大鼠血尿素氮、肌酐水平。
1.7 组织取材 抽取血液标本后采用颈椎脱臼法处死大鼠，开腹后迅速摘取心脏、肾脏，切取部分心肌组织及肾脏组织，置于4%多聚甲醛固定，24 h后脱水、透明、浸蜡、包埋，制作4 μm厚度的连续病理切片，进行HE染色。另取部分肾脏组织置于液氮中保存，用于Western blot实验。
1.8 HE染色 取肾脏组织、心肌组织切片，常规脱蜡，乙醇梯度水化，蒸馏水漂洗，加入苏木素浸泡5 min，蒸馏水漂洗，盐酸酒精分化，蒸馏水漂洗，移入Scott蓝化液返蓝，伊红液浸泡2 min，蒸馏水漂洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明两次，封片剂封固，置于光镜下观察肾脏组织、心肌组织病理变化，并拍照记录。
1.9 Western blot实验 取保存于液氮中的肾脏组织，研磨器充分研磨后采用PBS匀浆，移入离心管内，使用RIPA裂解液裂解细胞，冰上10 000 r/min离心12 min(离心半径10 cm)，经二喹啉甲酸法测定总蛋白并定量。取50 μg待测蛋白，混合4倍体积Loading Buffer缓冲液，加热沸腾5 min使蛋白变性，冰上10 000 r/min离心12 min(离心半径10 cm)，取上清液，80 V电压下进行SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白湿转至PVDF膜，使用5%脱脂奶粉常温封闭2 h，TBST液漂洗3次，5 min/次，加入兔抗大鼠PERK一抗、兔抗大鼠p-PERK一抗、兔抗大鼠eIF2α一抗、兔抗大鼠p-eIF2α一抗、兔抗大鼠CHOP一抗(稀释比均为1 ∶500)及GAPDH抗体(1 ∶2 000)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST液漂洗3次，5 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(稀释比为1 ∶2 000)，常温孵育2 h，ECL发光液浸泡30 s，移至暗盒显影，以GAPDH为内参，经凝胶成像分析仪分析PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP蛋白的相对表达量，并计算p-PERK/PERK比值和p-eIF2α/eIF2α比值。
1.10 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠肾脏组织的病理变化 对照组大鼠的肾小球细胞形态正常，组织结构完整，未发现炎性细胞浸润；
模型组大鼠的肾小球肥大变形、增生现象严重、组织结构被破坏，膜外基质增多，血管塌陷，间质存在大量炎性细胞浸润，肾小管萎缩；
虎杖苷组、联合组大鼠的肾小球部分肿胀、增生现象缓解，膜外基质积累较少，炎性细胞浸润较少，肾小管形态较正常，虎杖苷组大鼠的肾脏组织改善更加明显。见图1。
图1 各组大鼠肾脏组织的HE染色情况(×200)
2.2 各组大鼠心肌组织的病理变化 对照组大鼠的心肌细胞形态正常、排列紧致有序、组织结构完整，心肌纤维紧密，未发现炎性细胞浸润；
模型组大鼠的心肌细胞肿胀变形、排列松散混乱、组织结构被破坏，部分心肌纤维断裂消失，可见大量炎性细胞浸润；
虎杖苷组、联合组大鼠的心肌细胞肿胀减轻、轮廓基本正常，少见有心肌纤维断裂，局部可见炎性细胞浸润，虎杖苷组大鼠的心肌组织改善更加明显。见图2。
图2 各组大鼠心肌组织的HE染色情况(×200)
2.3 各组大鼠肾功能指标的比较 与对照组比较，模型组的24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平均升高(均P<0.05)；
模型组、联合组、虎杖苷组的尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平依次降低(均P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠肾功能指标的比较(x±s)
2.4 各组大鼠心脏功能指标的比较 与对照组比较，模型组的IVRT延长，二尖瓣E值降低，二尖瓣A值升高(P<0.05)；
模型组、联合组、虎杖苷组的IVRT、二尖瓣E值依次降低(均P<0.05)，二尖瓣A值依次升高(均P<0.05)。见表2。
表2 各组大鼠心脏功能指标的比较(x±s)
2.5 各组大鼠肾脏组织CHOP蛋白表达量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值的比较 与对照组比较，模型组的肾脏组织CHOP蛋白表达量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值均升高(均P<0.05)；
模型组、联合组、虎杖苷组的CHOP蛋白表达量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值依次降低(均P<0.05)。见表3、图3。
表3 各组大鼠肾脏组织CHOP蛋白相对表达量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值的比较(x±s)
图3 各组大鼠肾脏组织各蛋白的表达情况
NS是指由多种病因引起，以肾小球基膜通透性增加伴肾小球滤过率降低等肾小球病变为主的一组综合征，肾小球上皮细胞足突消失融合、肾小管间质纤维化、肾小球硬化是NS的主要病理变化[8]。NS的发病机制极为复杂，目前认为NS是肾小球屏障损伤、致蛋白尿因子异常、内质网应激、遗传因素等因素共同参与、相互影响的结果，其中内质网应激被认为是NS重要的发病机制之一[9]。肾小球足细胞损伤使其屏障作用消失，大量蛋白分子从隔膜裂孔中流出而形成蛋白尿，并引发机体炎症反应，加速肾脏组织病理变化，且长期蛋白尿可引发过度内质网应激，促进细胞凋亡，诱发心脏功能损伤[10]。Rojas-Franco等[11]认为，激活内质网应激可加速肾小管和肾小球细胞死亡，对急性肾损伤小鼠造成不利影响。因此，寻找高效、低风险的新药物以抑制内质网应激，对于减少蛋白尿、抑制炎症反应从而改善NS患者预后意义重大。
中医认为NS属于“水肿” “尿浊” “虚劳”范畴，为肺、脾、肾相干之病，其本在肾，主要病机为风邪侵肺、肺失宣降、脾肾不固、脾失转输、水液内停、肾失开阖，以致膀胱气化失司、气滞血瘀，终而发病，故治疗应以活血化瘀、祛风补肾为主[12]。中药虎杖取自蓼科植物虎杖的干燥根茎及根，性微寒，味微苦，归肝经、胆经、肺经，祛风、破瘀、通经，清代医学典籍《医林纂要》记载，虎杖可坚肾、强阳益精、壮筋骨、增气力。虎杖苷是提取自虎杖的一种天然芪类单体，其通过增强钠离子/钙离子蛋白交换、提升心肌细胞内外游离钙离子浓度，直接增强心肌收缩力，从而发挥增强心肌功能、抑制血栓形成的作用，可用于治疗心血管疾病[13]。El-Hameed[14]研究认为，虎杖苷可通过减轻肾脏炎症反应，对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠产生积极影响，提示虎杖苷可作为治疗肾脏疾病的潜在药物。曾晨等[15]采用虎杖苷干预经过缺氧诱导的大鼠心肌细胞，发现其可通过抗氧化作用来减轻心脏损伤，具有心肌保护作用。本研究结果显示，与模型组比较，虎杖苷组大鼠的24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平及二尖瓣A值降低，IVRT缩短，二尖瓣E值升高，这提示虎杖苷可改善阿霉素肾病大鼠的肾脏及心肌功能。
PERK/eIF2α/CHOP通路是内质网应激的主要信号传导通路，其中PERK是位于内质网膜上的一种Ⅰ型跨膜蛋白，可抑制内质网新生蛋白的合成[16]。当内质网应激发生后，PERK与其伴侣分子GRP78解离，在胞浆内磷酸化从而被激活，进而使下游效应因子eIF2α磷酸化，抑制蛋白质合成，同时p-eIF2α上调活化转录因子4的表达，当内质网应激过度发生后，活化的转录因子4促使CHOP转录，从而诱导相关细胞凋亡，造成组织损伤[17]。尽管NS的发病机制仍不明确，但越来越多的证据表明，内质网应激在其发病和进展中起着至关重要的作用，特别是在肾小管间质损伤中，抑制内质网应激可有效改善该病引起的脏器损伤[18-19]。Song等[20]发现，抑制PERK/CHOP通路可通过减轻内质网应激损伤，降低7-羟基甲氨蝶呤诱导的肾毒性，从而缓解急性肾损伤，提示PERK/CHOP通路在肾脏疾病中发挥重要作用。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠的肾脏组织CHOP蛋白表达量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值均升高，经虎杖苷干预后上述指标均降低，且在虎杖苷基础上加用PERK/eIF2α/CHOP通路激活剂CCT020312可减弱虎杖苷对阿霉素肾病模型大鼠肾脏及心肌的保护作用，这提示在阿霉素肾病模型大鼠中PERK/eIF2α/CHOP通路被异常激活，虎杖苷可能通过抑制该通路对阿霉素肾病模型大鼠的肾脏及心肌产生保护作用。
综上所述，虎杖苷可保护阿霉素肾病模型大鼠的肾脏及心脏功能，推测其作用机制与抑制PERK/eIF2α/CHOP信号通路有关。但本研究仍存在一定局限性，虎杖苷可能通过多靶点、多通路治疗阿霉素肾病大鼠，其具体的作用机制仍需进一步研究探讨。
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