陈高策，吴鑫雨，陈永，宋子乐，吴超，梁泽华*
1. 浙江中医药大学药学院（杭州 311499）；
2. 浙江民泰医药有限公司（杭州 311200）
黄精是常用的药食同源中药，有多种活性物质。将黄精制成蜜丸最早记载于《太平圣惠方》[1]中。徐宇琳等[2]对黄精的药食同源历史进行考究，考究发现黄精有补精髓、壮筋骨、延年益寿等补养之效。在现代药理研究中，黄精有增强免疫[3]、调节血糖血脂[4]、改善记忆[5]、防治骨质疏松[6]、抗癌[7-8]、抗衰老[9]、抗炎[10-11]等功效。而复方黄精大蜜丸是以黄精为主，辅以黄芪、人参、茯苓等药物制成的具有一定保健功效的产品。
衰老是机体的组织器官受到各种因素的影响，导致结构和功能发生不可逆的退行性变化。同时衰老会导致各类疾病如阿尔茨海默病、癌症等的发生率指数级增长。老年人口基数和比重的不断提高，给公共医疗卫生和社会养老带来极大挑战。因此，延缓人类衰老速度具有极为重要的社会意义[12]。
网络药理学是新兴学科，是一种基于疾病、药物、有效成分、靶点基因、靶点蛋白相互作用的系统的分析方法[13]。近年来广泛应用于中医药研究中，试验借助网络药理学的方法，研究以被称为“仙人余粮”的黄精作为主要成分的复方黄精大蜜丸，对抗衰老的潜在药效成分、作用靶点及信号通路，为黄精的多样化开发提供理论依据，开拓黄精作为保健食品的市场。
1.1 复方黄精大蜜丸的活性成分和靶点收集
运用TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索复方黄精大蜜丸的十味中药（黄精、黄芪、人参、茯苓、白芍、大枣、麻黄、生姜、松子仁、桂枝）的所有化学成分。接着根据口服生物利用度（OB）、类药性（DL）对每个化学成分以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件进行筛选。运用TCMSP数据库预测活性成分的作用靶点，借助Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/），限定基因来源为Homo sapiens且已验证，将收集到的靶点名称转化为规范的基因ID。运用Cytoscape 3.9.1构建“药物-活性成分-靶点”网络图。
1.2 衰老相关靶点收集
运用Gene Cards数据库（https：//www.genecards.org/）以“aging”为检索词进行检索以获得衰老相关靶点，Gene Cards数据库中Score值的高低和靶点与疾病联系的密切度呈正相关，根据经验最终筛选出Score值大于等于4.312 200 069的1 653个靶点纳入试验，将所得的靶点信息进行基因名和Uniprot ID的标准化，得到衰老的相关靶点。
1.3 “有效成分-疾病-靶点”网络图的绘制
将复方黄精大蜜丸活性成分靶点和疾病靶点取交集，得到交集靶点，利用Cytoscape 3.7.2软件绘制“有效成分-疾病-靶点”网络图，根据degree值筛选出主要有效成分。
1.4 交集靶点PPI网络构建
将药物与疾病交集靶点上传到STRING数据库（https：//string-db.org）进行PPI网络的构建，限定物种为“Homo sapiens”，隐藏游离节点，参数均为默认设置，得到PPI网络文件，将其导入Cytoscape 3.9.1作图并美化。
1.5 交集靶点GO和KEGG富集分析
将交集靶点数据导入David平台（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）限定物种为“Homo sapiens”分析其生物学过程与通路，将数据运用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化处理。
1.6 分子对接
将“有效成分-疾病-靶点”网络图中degree较高的3个有效成分与PPI网络中degree值最高的7个核心靶点进行分子对接。从TCMSP数据库获取有效成分的MOL2格式文件，从PDB数据库（http：// www.rcsb.org/pdb）获取核心蛋白质的PDB格式文件。使用AutoDockTools 1.5.7和PyMOL4.6.0对核心蛋白质进行去除水分子、金属离子，分离配体和受体，加氢，转化文件格式等操作。对接过程使用AutoDock Vina 1.1.2执行，将结果制成热图，并将结合能最低的模型运用PyMOL4.6.0进行可视化。
2.1 复方黄精大蜜丸的活性成分和靶点收集
从TCMSP数据库中筛出药物活性成分，其中白芍活性成分6个、大枣活性成分15个、茯苓活性成分3个、桂枝活性成分5个、黄精活性成分6个、黄芪活性成分11个、麻黄活性成分12个、人参活性成分10个、生姜活性成分3个、松子仁活性成分1个。筛选得到活性成分靶点分别有白芍79个、大枣188个、茯苓20个、桂枝42个、黄精75个、黄芪189个、麻黄203个、人参102个、生姜47个、松子仁19个。去除重复后，共得到活性成分26种，活性成分靶点259个。
2.2 衰老相关靶点收集
以“aging”为检索词在上述GeneCards数据库中进行检索，收集相关靶点，筛选得到相关靶点1 653个，将疾病靶点与活性成分靶点取交集，使用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）制作韦恩图最终得交集靶点160个，见图1。
图1 复方黄精大蜜丸活性成分靶点与衰老相关靶点韦恩图
2.3 “有效成分-疾病-靶点”网络图的绘制
使用Cytoscape 3.9.1对160个交集靶点进行“有效成分-疾病-靶点”网络图的绘制，见图2。根据度值筛选较为重要的活性成分，其中，槲皮素、山奈酚、异鼠李素的度值明显较高，这些成分可能是复方黄精大蜜丸抗衰老的核心成分，见表1。
图2 “有效成分-疾病-靶点”网络图
表1 复方黄精大蜜丸主要的活性成分信息
图2中，方形图标代表疾病与药物的交集靶点，周围的圆形图标代表药物的各个组分。图形的大小由degree值决定，degree值越大图形越大。
2.4 交集靶点PPI网络构建
将上述160个交集靶点导入STRING数据库，获取PPI网络图，去除游离靶点后，导入Cytoscape 3.9.1进行直观的拓扑分析，节点的大小和颜色的变化根据degree值而设定，degree值越大节点面积越大，颜色越深，反之节点面积越小，颜色越浅；
边线条的粗细和颜色的变化由Combined Score值决定，Combined Score越高连线越粗，颜色越深，反之连线越细，颜色越浅，见图3。将degree值排名前7的蛋白筛选出来，见表2，复方黄精大蜜丸可能主要通过这些靶点起抗衰老的作用，认为这些靶点是复方黄精大蜜丸抗衰老的核心靶点。
图3 复方黄精大蜜丸抗衰老靶点PPI网络
表2 PPI网络中degree值排名前7的靶点
2.5 交集靶点GO和KEGG富集分析
运用David数据库对复方黄精大蜜丸抗衰老相关靶点进行信号通路分析。运用微生信进行可视化处理后，得到GO分析和KEGG分析图，见图4和图5。可见“交集靶点”参与的生物学过程（BP）主要包括等RNA聚合酶II启动子转录的正调控，基因表达的正向调控，信号转导，对药物的反应，DNA模板转录的正向调控，细胞增殖的正调节以及凋亡过程的负调控等。“交集靶点”细胞组分（CC）富集在质膜、胞质溶胶、细胞质、细胞核、核质、膜的组成部分、细胞外空间，细胞外区等。“交集靶点”主要分子功能（MF）富集在蛋白质结合、相同的蛋白质结合、酶结合、金属离子结合、蛋白质同二聚化活性等。
图4 复方黄精大蜜丸抗衰老交集靶点的GO富集分析图
图5 复方黄精大蜜丸抗衰老交集靶点的KEGG富集分析图
KEGG富集分析进一步解释复方黄精大蜜丸抗衰老的潜在机制，发现参与的通路主要有PI3K-Akt信号通路、化学致癌-受体激活、MAPK信号通路，这些通路可能是复方黄精大蜜丸抗衰老的关键通路。此外还有如癌症通路、脂质和动脉粥样硬化等通路，表明复方黄精大蜜丸可能参与相关疾病的调节。
2.6 分子对接
图8 槲皮素与TNF分子对接结果
将复方黄精大蜜丸的核心成分槲皮素、山奈酚、异鼠李素和核心靶点AKT1（PDBID：3MV5）、TNF（PDBID：3L0V）、IL6（PDBID：2E43）、TP53（PDBID：5AB9）、IL1B（PDBID：4GAI）、CASP3（PDBID：1NMS）、VEGFA（PDBID：1VPP）进行分子对接，计算核心成分和核心靶点之间的结合能，预测其的结合活性，见图6。一般认为结合能＜-5.0 kcal/mol表示具有较好的结合效果，所有的对接结果均小于0，且小于-5.0 kcal/mol，可见核心成分与核心靶点之间都能够良好结合，证实复方黄精大蜜丸具有一定抗衰老功效。另外，核心成分槲皮素和核心靶点TNF结合能为-8.7 kcal/mol是所有对接结果中最小的结果，说明槲皮素也许能通过作用于TNF起到抗衰老的效果。对接结合能最小的3个模型运用PyMOL4.6.0展示两者间的相互作用，见图7～图9。其中，虚化部分为核心靶点，未虚化部分为核心成分。
图6 分子对接结合能热图
图7 槲皮素与AKT1分子对接结果
图9 山奈酚与TNF分子对接结果
衰老是人类无法避免的最终结果，但是能够通过抗衰老延长人类寿命及提高晚年的生活质量。同时抗衰老从社会层面上说，能够缓解医疗卫生的压力，减轻年轻劳动者的负担。抗衰老药物被分为化学药物治疗，生物治疗及中药治疗。化学药物治疗的药物有阿司匹林、雷帕霉素、二甲双胍和白藜芦醇等药物。但是在服用的同时有明显的高血糖、高脂血症、肾脏毒性、免疫抑制、恶心、呕吐不适等不良反应。生物治疗包括干细胞移植、粪便微生物移植、激素替代疗法、年轻血液置换等。但其实际应用尚需克服诸多难点，如干细胞移植可能会产生免疫排斥反应、出血和感染等风险；
粪便微生物移植在实际情况中存在健康捐献者粪便的筛选、移植方式及可能存在病原体传播同时又缺乏标准化治疗方案等问题。中药治疗主要通过清除自由基，提高抗氧化酶活性以及增强免疫功能的方式抗衰老[12]。中药治疗有着明显优势，如部分药物药食同源，毒性小或无毒性，无明显不良反应，药物的依顺性较好可以长期服用。
中医抗衰老理论主要集中于肾元气虚致衰说、五脏虚损致衰说、阴阳失和致衰说、气血失和致衰说以及气虚、血虚、血瘀致衰说等。其中，肾元气虚致衰说被广为接受。肾为衰老之根，脾为衰老之源[14]。因此中医理论上的抗衰老主要在于对肾和脾的补益作用。复方黄精大蜜丸，以黄精为主要成分，辅以黄芪、人参、茯苓等药物。而黄精有补气养阴，健脾，益肾的功效，被称为“仙人余粮”，古书上记载“神仙饵黄精方，黄精十斤，洗净，蒸令烂熟，白蜜三斤，件药相和，捣一万杵，圆如梧桐子大，每服以温酒三十圆，日三服，久服神仙矣”。黄芪、人参、茯苓、白芍、大枣、生姜等均有不同程度的补脾健脾的功效。互相配伍能够起到“1+1＞2”的作用。复方黄精大蜜丸味甘甜，口感绵密，便于服用且依顺性较为良好。本研究使用网络药理学及分子对接的方法，探讨复方黄精大蜜丸抗衰老的可能机制，为复方黄精大蜜丸的进一步开发提供基础。
根据“有效成分-疾病-靶点”网络图筛选出的3个有效成分槲皮素、山奈酚、异鼠李素均为黄酮类。有研究证明槲皮素可以增强线粒体生物发生与氧化磷酸化作用，并降低与线粒体相关的细胞凋亡达到延长老年低额溞寿命的作用[15]。异鼠李素可以通过减轻氧化应激，延缓D-半乳糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老[16]。但是山奈酚抗衰老的内容较少，值得后续进行研究。
通过药物与疾病的交集靶点制得的PPI网络图筛选得到degree值最高的7个复方黄精大蜜丸抗衰老的核心靶点，分别为AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、CASP3、VEGFA，其中AKT1的degree值最高，其可能是复方黄精大蜜丸抗衰老的关键靶点AKT1[17]，通过调节细胞的自噬从而抑制细胞的衰老。Figueira等[18]发现，年龄相关的炎症因子如IL-6、TNF-α表达异常与衰老有关。肿瘤蛋白p53（TP53）是一种肿瘤抑制蛋白，其调控肿瘤发生与衰老进程。相关试验表明，过表达TP53可诱导细胞衰老，在小鼠体内异常激活p53可降低肿瘤发生率，但也导致小鼠衰老。进一步研究发现，高表达且受到正常调控的p53在提高机体对肿瘤耐受性的同时，不会导致过早衰老和寿命缩短[19]。
GO分析与KEGG富集分析是分析基因功能的有效方法，GO分析表明复方黄精大蜜丸抗衰老涉及多个生物学过程，如RNA聚合酶II启动子转录的正调控，基因表达的正向调控，信号转导，对药物的反应，DNA模板转录的正向调控，细胞增殖的正调节及凋亡过程的负调控等。KEGG结果表明交集靶点主要富集在PI3K-Akt信号通路、化学致癌-受体激活、MAPK信号通路等上。这些通路可能是复方黄精大蜜丸抗衰老的主要通路。PI3K-Akt信号通路是细胞内重要的通路之一，参与调控细胞分化、增殖和凋亡等多种生理活动，常与转录因子NF-E2相关因子2共同作用，以调节氧化应激造成的细胞损伤，该通路被激活可延缓机体衰老[20]。赖文芳等[21]发现红景天苷能够改善MCAO大鼠的神经功能损伤，抑制神经细胞凋亡，主要是通过激活PI3K-AKT信号通路，促进AKT的磷酸化，激活NRF2的核转录，促进HO-1的蛋白表达，进而抑制神经细胞凋亡，改善神经功能。Ali等[22]发现花青素通过激活PI3K-Akt-Nrf2信号通路降低ROS水平，减轻氧化应激引起的细胞损伤及阿尔茨海默病小鼠的神经退行性改变，从而延缓衰老。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是重要的信号转导酶，参与调节细胞凋亡、细胞增殖分化和衰老等[23]。杨晓露等[24]发现，甘草总黄酮能抑制细胞中炎症因子的表达，下调激活MAPK信号通路中磷酸化的ERK（p-ERK）蛋白表达，通过调控ERK-MAPK通路发挥抗炎、抗氧化作用，延缓衰老。宋来新等[25]发现，淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠炎症反应具有保护作用，其作用机制可能是通过抑制MAPK信号通路的激活，从而抑制NF-κB的核易位及其下游炎症细胞因子表达，进而延缓脑衰老。最后，3个核心成分与7个核心靶点的分子对接结果展示核心靶点与核心成分之间良好的结合活性，这也印证复方黄精大蜜丸抗衰老的科学性。
试验运用网络药理学的方法，筛选出复方黄精大蜜丸抗衰老的3个主要活性成分，这些活性成分可能通过AKT1、TNF、IL6、TP53等关键靶点，参与PI3KAkt信号、MAPK信号等通路，发挥RNA聚合酶II启动子转录的正调控，基因表达的正向调控，信号转导，对药物的反应，DNA模板转录的正向调控，细胞增殖的正调节及凋亡过程的负调控等作用从而达到抗衰老目的，同时分子对接也验证了核心靶点与核心成分的高度结合活性。试验初步阐明复方黄精大蜜丸抗衰老的主要药效成分及其可能的作用靶点和相关通路，为后续以黄精为主要成分的保健食品进一步开发提供思路和方向。
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