居 蕾,曹雨辰,樊莉萍
1.复旦大学附属妇产科医院产科，上海 200090；
2.上海市第一妇婴保健院产科，上海 200120
妊娠期高血压疾病常常发生在妊娠20周左右，以全身小血管痉挛为主要病理生理改变，常引起其他并发症，其发生率为9.4%～10.4%，病死率达27.5%，对母婴健康造成严重威胁[1-2]。
妊娠期高血压疾病最早累及的器官为肾脏，因此寻找早期敏感的肾损伤评估指标，对于早期干预和改善妊娠结局具有重要的临床意义。肾损伤分子(KIM)-1是评价肾损伤的指标，但其诊断肾损伤的效能有限[3]。微小RNA(miRNA)是一类由19～25个核苷酸组成的RNA，在妊娠期高血压疾病和肾损伤的发生、发展过程中具有重要作用[4]。有研究显示，miR-210在妊娠期高血压疾病患者中呈高表达，其水平随着妊娠期高血压疾病严重程度的增加而明显升高[5]，但其是否能够用于评估妊娠期高血压疾病患者肾损伤情况仍不清楚。还有研究显示，先兆子痫患者的胎盘中miR-218-5p表达水平明显降低，miR-218-5p可通过调节血管内绒毛外滋养细胞分化和螺旋动脉重塑，从而阻碍先兆子痫的发生、发展[6]，但miR-218-5p是否对妊娠期高血压疾病患者肾损伤具有诊断作用仍不清楚。本研究探讨了联合检测血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1水平对妊娠期高血压疾病患者肾损伤的诊断效能，现报道如下。
1.1一般资料 选择2019年1月至2020年12月复旦大学附属妇产科医院诊断为妊娠期高血压疾病的患者106例为研究组，患者年龄21～40岁，平均(28.97±3.84)岁；
体质量指数(BMI)为(22.18±1.23)kg/m2；
平均孕周(34.62±1.29)周。选择同期健康产检孕妇75例为对照组，年龄22～39岁，平均(28.02±2.94)岁；
BMI为(22.32±1.18)kg/m2；
平均孕周(34.72±1.22)周。纳入标准：妊娠前无高血压；
年龄21～40岁；
单胎妊娠；
妊娠前无肾损伤。排除标准：合并原发性高血压、糖尿病和肾病；
合并胎盘早剥、先兆流产和前置胎盘；
合并免疫性疾病和肿瘤；
合并代谢性疾病等。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会审核通过。
1.2诊断标准及分组 根据《妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)》[7]中妊娠期高血压疾病严重程度分类标准，将妊娠期高血压疾病患者分为妊娠期高血压组(38例)、轻度子痫前期组(36例)和重度子痫前期组(32例)。妊娠期高血压诊断标准：妊娠20周后首次出现高血压，收缩压(SBP)≥140 mm Hg和(或)舒张压(DBP)≥90 mm Hg，尿蛋白检测阴性,在产后12周内血压恢复正常，即可诊断为妊娠期高血压。轻度子痫前期诊断标准：妊娠20周达妊娠期高血压的诊断标准，同时符合下列任何1项，(1)随机尿蛋白≥0.3 g/24 h或者随机尿蛋白≥+，或者尿蛋白/肌酐比值≥0.3；
(2)虽然无尿蛋白但伴有任何一种器官或者系统(包括心、肝、肾、肺等重要器官或者神经系统、消化系统和血液系统等)受累，即可诊断为轻度子痫前期。重度子痫前期诊断标准：子痫前期患者出现下述任何1项表现，(1)肾功能受损，血肌酐>106 μmol/L；
(2)随机尿蛋白≥2.0 g/24 h或随机尿蛋白≥++；
(3)血液系统异常，血小板<100×109/L，微血管溶血；
(4)血清转氨酶水平升高；
(5)持续性头疼或视觉障碍；
(6)血压持续升高不可控制；
(7)SBP≥160 mm Hg和(或)DBP≥110 mm Hg；
(8)低蛋白血症伴胸腔积液、腹水和心包积液；
(9)心功能衰竭；
(10)肺水肿；
(11)胎儿生长受限、胎盘早剥和胎死宫内等，即可诊断为重度子痫前期。根据妊娠期高血压疾病患者内生肌酐清除率(Ccr)将其分为肾功能正常组(Ccr≥80 mL/min，67例)和肾功能异常组(Ccr<80 mL/min，39例)。
1.3方法
1.3.1血液标本收集 研究组于患者入院后，对照组于产检时抽取肘静脉血约5 mL，在室温下静置约20 min，然后以3 000 r/min离心10 min，离心半径为15 cm，取上清液约3 mL，放置在-80 ℃冰箱中保存待测。
1.3.2血清β2微球蛋白(β2-MG)、KIM-1水平检测 采用全自动生化分析仪(美国Beckman公司)检测血清β2-MG水平，采用酶联免疫吸附试验检测血清KIM-1水平。
1.3.3miR-210、miR-218-5p水平检测 采用TaqMan miRNA试剂盒提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血清miR-210和miR-218-5p水平。根据目标基因的mRNA序列设计引物，用Primer Express 3.0软件设计反转录产物为模板，miR-210上游引物：5′-GCTGTGCGTGTGACAGC-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；
miR-218-5p上游引物：5′-CGCAGTTGTGCTTGATCT-3′，下游引物：5′-TCCAGTTTTTTTTTTTTTTTACATGGT-3′；
GAPDH上游引物：5′- GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物：5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′。反转录后以反转录产物为模板，用ABI 7900型RT-qPCR仪(美国ABI公司)进行检测，反应体系：引物1 μL，cDNA 1 μL，TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL，加入双蒸水将反应体系补充至20 μL。反应条件：85 ℃ 3 min，85 ℃ 20 s，42 ℃ 40 s，循环35次。采用2-ΔΔCt法计算miR-210和miR-218-5p相对表达水平。
1.3.4观察指标 比较研究组与对照组血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平；
比较不同妊娠期高血压疾病严重程度患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平；
比较不同肾功能患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平；
评估血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG对妊娠期高血压疾病患者肾损伤的诊断效能；
分析妊娠期高血压疾病患者血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1水平间的相关性。
2.1研究组与对照组血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比较 研究组血清miR-210、KIM-1和β2-MG水平明显高于对照组，血清miR-218-5p水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 研究组与对照组血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比较
2.2不同妊娠期高血压疾病严重程度患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比较 重度子痫前期组血清miR-210、KIM-1和β2-MG水平明显高于轻度子痫前期组和妊娠期高血压组，血清miR-218-5p水平明显低于轻度子痫前期组和妊娠期高血压组，差异有统计学意义(P<0.05)；
轻度子痫前期组血清miR-210、KIM-1和β2-MG水平明显高于妊娠期高血压组，血清miR-218-5p水平明显低于妊娠期高血压组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 不同妊娠期高血压疾病严重程度患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比较
2.3不同肾功能患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比较 肾功能异常组血清miR-210、KIM-1和β2-MG水平明显高于肾功能正常组，血清miR-218-5p水平明显低于肾功能正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 不同肾功能患者血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG水平比较
2.4血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG对妊娠期高血压疾病患者肾损伤的诊断效能 血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1单独检测诊断妊娠期高血压疾病患者肾损伤的曲线下面积(AUC)均高于β2-MG(P<0.05)，因此将miR-210、miR-218-5p、KIM-1用于联合诊断，根据是否发生肾损伤进行二元Logistic回归得方程Y=1.32XmiR-210-4.88XmiR-218-5p+0.55XKIM-1-6.87，将其作为联合检测指标，联合检测的灵敏度为84.6%，特异度为95.5%，AUC为0.957，其AUC明显优于miR-210、miR-218-5p和KIM-1单独检测(P<0.05)。见表4和图1。
表4 血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG对妊娠期高血压疾病患者肾损伤的诊断效能
图1 血清miR-210、miR-218-5p、KIM-1和β2-MG诊断妊娠期高血压疾病患者肾损伤的ROC曲线
2.5妊娠期高血压疾病患者血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1水平间的相关性分析 妊娠期高血压疾病患者血清miR-210和KIM-1水平与miR-218-5p水平均呈负相关(r=-0.555、-0.542，P<0.05)，而血清miR-210与KIM-1水平呈正相关(r=0.575，P<0.05)。
妊娠期高血压疾病患者主要表现为血压升高、头痛头晕、抽搐、水肿和蛋白尿，部分患者甚至出现昏迷，其导致的肾脏部位小动脉硬化可以直接引起肾损伤，危及母婴健康[8]。肾损伤常规评估指标是血清尿素氮和肌酐，但只有当肾小球滤过率下降到50%以下时这些指标才会出现明显升高。β2-MG是由免疫细胞产生的糖蛋白，在肾功能正常的情况下其经肾小球滤过后几乎被肾小管全部重吸收，血液和尿液中含量很少，其也常常被用于肾损伤的评估[9]。本研究显示，血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1单独检测诊断妊娠期高血压疾病患者肾损伤的效能明显优于β2-MG，说明miR-210、miR-218-5p和KIM-1具有更高的诊断价值，故本研究进一步将miR-210、miR-218-5p和KIM-1联合用于妊娠期高血压疾病患者肾损伤的诊断，结果显示，联合检测的AUC为0.957，明显高于各项指标单独检测，具有较高的临床推广应用价值。
本研究中，研究组血清KIM-1水平明显高于对照组，并且随着妊娠期高血压疾病严重程度的增加，血清KIM-1水平逐渐升高，提示血清KIM-1与妊娠期高血压疾病的发生、发展有关，与文献报道的结论一致[10]。KIM-1是一种Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族黏附分子成员，KIM-1细胞外结构被金属蛋白酶切割后形成可溶性的KIM-1，并释放到血液和尿液中。肾功能正常的患者血清KIM-1水平极低甚至不表达，而在肾小管受损的患者中KIM-1水平明显升高[11]。本研究显示，肾功能异常组血清KIM-1水平明显高于肾功能正常组，且当血清KIM-1取截断值为8.74 ng/mL时，其诊断妊娠期高血压疾病患者肾损伤的灵敏度为82.1%，特异度为76.1%，AUC为0.825，具有较高的诊断价值，与文献报道的结果相近[12]。KIM-1能够引起肾血流量下降和肾小球滤过率降低，是早期肾小管损伤的重要标志物之一，因此其水平变化对于肾损伤的诊断具有重要的临床意义。
研究表明，miRNA参与了妊娠期高血压疾病的发生、发展过程，采用基因芯片技术检测发现，妊娠期高血压疾病患者出现多种miRNA表达异常[13]。本研究显示，研究组血清miR-210水平明显高于对照组，并且随着妊娠期高血压疾病严重程度的增加血清miR-210水平也逐渐升高，说明miR-210参与了妊娠期高血压疾病的发生、发展过程，与文献报道一致[14]。miR-210在机体缺氧环境中呈高表达，组织缺氧越严重其表达水平越高，在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中存在不同程度的缺氧，因此miR-210可以作为胎盘组织缺氧严重程度的评估指标[15-16]。当血清miR-210取截断值为5.77时，其诊断妊娠期高血压疾病患者肾损伤的灵敏度为74.4%，特异度为89.6%，AUC为0.887，具有较高的诊断效能。本研究中，研究组血清miR-218-5p水平明显低于对照组，并且随着妊娠期高血压疾病严重程度的增加，血清miR-218-5p水平逐渐降低。子痫前期的发病机制较为复杂，一般认为是胎盘和母体之间的相互作用导致的，侵袭性绒毛外滋养细胞的破坏作用是子痫前期的重要促成因素，表现为胎盘组织中的绒毛外滋养细胞浸润，血管绒毛外滋养细胞分化障碍，母体螺旋动脉重塑不足，最终发展为子痫前期[17]。现有研究显示，miR-218-5p能诱导滋养层侵袭，促进绒毛外滋养细胞向血管内绒毛外滋养细胞分化，加速螺旋动脉重塑[18]。子痫前期患者由于miR-218-5p表达水平降低，导致绒毛外滋养细胞分化受限，抑制了螺旋动脉重塑。本研究还发现，血清miR-218-5p取截断值为1.22时，诊断妊娠期高血压疾病患者肾损伤的灵敏度为82.1%，特异度为71.6%，AUC为0.803，具有较高的诊断价值。
相关性分析发现，妊娠期高血压疾病患者血清miR-210和KIM-1水平与miR-218-5p水平均呈负相关(P<0.05)，血清miR-210水平与KIM-1水平呈正相关(P<0.05)，各指标水平间具有相关性的具体机制仍需要进一步研究。
综上所述，血清miR-210、miR-218-5p和KIM-1水平与妊娠期高血压疾病的发生、发展有关，且对患者肾损伤具有较高的诊断价值，联合检测的诊断价值优于各指标单独检测。
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