全无瑕，缪延栋，米登海
扩张型心肌病(DCM)是一种以左心室扩张和收缩功能障碍为主要表现的非缺血性心肌疾病，编码细胞骨架和核膜蛋白的基因突变占病例总数的35%，世界卫生组织将扩张型心肌病定义为严重的心脏紊乱，发病率和死亡率较高，也可导致心力衰竭和心律失常等并发症的发生[1-3]。由于扩张型心肌病有大量的基因和等位基因，基因诊断可以帮助预测预后，特别是某些亚型心律失常的风险[4]。
中医药作为我国最受欢迎的补充和替代医学模式之一，因其疗效明显、资源丰富、毒性低而逐渐被国际专家认可，并在西方国家得到越来越多的应用[5]。在扩张型心肌病的临床治疗中，有许多中成药和中药注射剂单独使用或作为常规化疗的辅助手段[6-8]。芪苈强心胶囊主要由黄芪、人参、附子、丹参、葶苈子、泽泻、玉竹、桂枝、红花、香加皮、陈皮等组成，具有益气温阳、活血通络、利水消肿之功效，适用于心力衰竭阳气虚乏、络瘀水停证的治疗，在临床治疗心血管相关疾病方面取得很好的疗效，并且是少数经过严格、科学、客观的临床试验评价进入临床指南的中成药之一[9-11]。然而，该中成药治疗心脏病，特别是扩张型心肌病的药理过程和分子机制尚未得到详细的阐述。因此，本研究采用生物信息学的方法，对芪苈强心胶囊治疗扩张型心肌病的化合物与生物学特征进行初步分析，为该方进一步的实验研究与开发奠定基础。
复方中药网络药理学是通过整合系统生物学、高通量筛选、网络分析及网络可视化等多种技术，揭示“疾病-基因-靶点-中药”相互作用的复杂体系，系统性分析中药对机体疾病的干预与影响[12]。通过中药与中药之间的化学结构、功效等方面的相似性，结合机体靶点分子、生物学效应的复杂相互作用关系，通过构建药物-化合物-靶标等网络，可有效预测药物功能或特定功能所对应的药物，是目前现代中药药效物质基础研究的重要手段之一[13]。分子对接技术是一种基于配体化合物与受体大分子三维结构的结合作用，通过计算物理化学等参数评价二者间的相互作用，从而达到筛选辅助药物的目的，现已广泛用于基于特定靶标的中药及复方活性成分的研究[14]。
本研究利用复方中药网络药理学的方法结合分子对接技术，以芪苈强心胶囊作为研究对象，对药物治疗靶点进行发掘，通过构建特定的“中药活性成分-靶点-药理”的复方调控网络，评价中药的合理性和相容性。探究芪苈强心胶囊治疗扩张型心肌病的活性成分和潜在的靶基因以及基因相关的功能和介导的通路，从而进一步阐明药理作用及分子机制，为现代中药的研究和开发提供新思路。
1.1 资料来源 本研究采用公共数据库与数据分析软件，其中数据库包括中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmspw.com)[15]、靶点蛋白数据库 UniProt(https：//www.uniprot.org)[16]、基因名片数据库(GeneCards®：the human gene database，https：//www.genecards.org)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM®：online mendelian inheritance in man，https：//omim.org)[17]、PharmGKB 数据库(https：//www.pharmgkb.org)[18]、治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)[19]、DrugBank 数据库(https：//go.drugbank.com/)[20]、String 网站(https：//string-db.org/)、小分子化合物结构查询数据库PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[19]、RSCB 蛋白质结构数据库(protein data bank，PDB，https：//www.rcsb.org/)[21]。分析软件包括网络拓扑分析软件 Cytoscape 3.8.0[22]、化学结构绘图分析软件(ChemBio3D Ultra 14.0)、分子可视化系统软件PyMOL 2.4.0、分子对接软件AutoDock、Vina及数据分析软件 R软件3.6.2、Strawberry Perl-5.32.0.1及绘图软件GraphPad Prism 8。
1.2 方法
1.2.1 筛选芪苈强心胶囊中活性成分及靶点蛋白 通过TCMSP以芪苈强心胶囊中所含的11味中药材(黄芪、人参、附子、丹参、葶苈子、泽泻、玉竹、桂枝、红花、香加皮、陈皮)为关键词检索其化学成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为指标筛选各味药中活性成分[12]，同时下载有效成分的人源靶点信息。通过 UniProt 数据库查找相关靶标蛋白的基因名，采用perl 语言将查询到的靶点蛋白名称转化为相应基因简称。采用GraphPad Prism 8软件绘制药材中活性成分柱状图。
1.2.2 疾病靶点基因的筛选及“活性成分-靶点”网络的构建 以扩张型心肌病作为关键词分别在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD 以及DrugBank数据库筛选出扩张型心肌病相关的基因，通过R软件利用R包“venn”，将疾病相关的基因以及药物靶点基因取交集，获得药物靶点基因，然后导入Cytoscape 3.8.0 软件中构建“中药-活性成分-靶点”调控网络。通过String网站构建药物和疾病基因的蛋白互作(protein-protein interactive，PPI)网络。然后使用CytoNCA 插件(2.1.6版)对这些节点的拓扑评分进行综合计算、评估和可视化分析，查找网络核心基因，以中心度值(betweenness centrality，BC)、邻近度值(closeness centrality，CC)、度值(degree centrality，DC)和特征向量值(eigenvector centrality，EC)、局部平均连通性(LAC)及网络值(network centrality，NC)作为筛选项目。
1.2.3 靶点基因功能注释与通路分析 功能注释主要通过基因本体分析(gene ontology，GO)，分为生物过程(biological processes，BP)、细胞组成(cellular components，CC)或分子功能(molecular functions，MF)3类。京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)揭示已鉴定基因的生物信息及信号转导通路。为了探究药物和疾病靶点基因的功能与信号转导途径，通过R软件利用R包“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”进行靶基因的GO功能注释、KEGG信号通路富集分析以及可视化。
1.2.4 “活性成分-靶点” 的分子对接 首先，在PubChem数据库中下载PPI网络中最核心基因JUN和TP53相关联的活性成分化合物的2D结构，保存为sdf格式文件，采用ChemBio3D Ultra 14.0转换为3D结构，并进行能量优化，保存为mol2格式文件。其次，从RSCB 蛋白质结构数据库(PDB)中下载JUN的晶体复合物的三维结构(PDB ID：5FV8)和TP53(PDB ID：7BWN)的晶体复合物的三维结构用于分子对接研究，保存为pdb格式文件。运用PyMOL 2.4.0软件对靶点蛋白进行修饰，移除其中的水分子和小分子配体，保存为pdbqt格式文件。并利用AutoDock软件对JUN和TP53的三维结构进行加氢并保存为pdbqt格式文件，同时将活性成分化合物的格式转换为pdbqt格式文件，确定活性口袋，并保留参数。最后，运用vina软件完成分子对接，结合能小于0说明受体与配体间可以自发结合，研究选取结合能≤-20.9 kJ/mol 的活性成分作为芪苈强心胶囊治疗扩张型心肌病靶点的筛选依据[12]。
2.1 中药活性成分的筛选 通过TCMSP共获得芪苈强心胶囊中11味中药的化合物共1 271种，其中，丹参202种，红花189种，人参190种，附子65种，黄芪87种，香加皮79种，葶苈子68种，泽泻46种，玉竹62种，桂枝220种，陈皮63种。在这些成分中，209种(16.44%)成分OB≥30%且DL≥0.18。其中，丹参65种，红花22种，人参22种，附子21种，黄芪20种，香加皮17种，葶苈子12种，泽泻10种，玉竹8种，桂枝7种，陈皮5种。芪苈强心胶囊中部分化合物基本信息见表1。
表1 芪苈强心胶囊中部分活性成分及化合物的基本信息
(续表)
2.2 筛选中药与疾病靶点基因 共获得3 322个扩张型心肌病相关基因，各数据库中的基因数量见图1。与中药靶点基因取交集，共获得161个药物-疾病靶点基因(见图2)。
图1 各数据库筛选扩张型心肌病相关基因数
图2 中药与疾病靶点基因
2.3 “中药-活性成分-靶点” 相互作用网络 在本研究中，首先构建了芪苈强心胶囊活性成分和扩张型心肌病靶基因之间的复方调控网络(见图3)，蓝色矩形代表靶点基因，圆形模块表示中药活性成分，该网络由291个节点组成，其中，圆形130个节点是中药生物活性成分，外周161个节点是靶点基因。除MOL000296(常春藤素)、MOL000449(豆甾醇)、MOL000098(槲皮素)、MOL000354(异鼠李素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000358(β-谷甾醇)、MOL000006(木犀草素)、MOL000359(谷甾醇)分别来源于多种中药外，其余生物活性分成均来自单一中药，由于靶点众多，选取最关键的部分进行可视化。丹参、红花、人参、黄芪、香加皮这5味中药的活性成分最多，尤其是丹参，是该组方中的最关键药物，130个生物活性成分中54个来源于丹参。161个靶点基因通过String网站构建PPI网络(关联分数=0.9)，见图4。随后导入Cytoscape软件，采用 CytoNCA插件，以BC、CC、DC、EC、LAC 及NC作为筛选标准，首先获得139个节点和685条边的调控网络图(见图5)，其中一个节点的度值代表网络中与节点连接的路线数目。在此基础上，继续按照上述标准获得45个节点和294条边的调控网络图(见图6)。最后再次进行筛选，获得15个节点和74条边的调控网络图(见图7)。综合上述筛选指标，获得排名前2位的靶点蛋白是JUN和TP53。
图3 中药活性成分-靶点网络图
图4 161个靶点基因PPI网络图
图5 139个基因的调控网络图
图6 45个基因的调控网络图
图7 15个核心基因的调控网络图
2.4 GO功能注释和KEGG通路分析 为了详细了解上述靶点基因的生物学特性，采用R软件，以基因数目≥3和错误发生率(FDR)<0.001作为筛选值对上述161个靶点基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。
2.4.1 GO功能注释分析 GO功能注释分析获得1 180个BP条目，其中，46个条目涉及CC，70个条目涉及MF。主要涉及毒物质、脂多糖、营养水平、细胞外刺激、金属离子等与心肌细胞损伤相关的生物作用。前25条通路以及所参与调控的基因见图8。GO富集分析中BP、CC、MF 前10位的基因条目见图9。
图8 GO功能注释分析前25条通路及靶点
图9 GO富集分析中BP、CC和MF排名前10位的基因
2.4.2 KEGG通路分析 KEGG通路分析获得174条信号通路(P<0.05)，涉及人巨细胞病毒感染(参与基因主要包括PTGS2、RELA、AKT1、MAPK3、MAPK1等)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(参与基因主要包括RELA、AKT1、BCL2、MAPK3、MAPK1等)、流体剪应力与动脉粥样硬化(参与基因主要包括RELA、AKT1、BCL2、GSTP1、MMP9、JUN、TP53等)、乙型肝炎(参与基因主要包括RELA、AKT1、BCL2、MAPK3、MAPK1等)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等通路(参与基因主要包括PTGS2、RELA、AKT1、MAPK3、MAPK1等)。选取P值较小的前30个通路进行可视化，结果见图10。
图10 KEGG通路分析排名前30位的信号通路
2.5 芪苈强心胶囊核心化合物作用与JUN和TP53的分子对接 一般认为受体与配体相互作用的亲和力越强，所需要的能量越少，其发生作用的可能性越大。将芪苈强心胶囊在“中药-成分-靶点”网络中的中心度值、亲中心度值及等级值综合排名前2位的靶点蛋白分别与药物中的核心化合物进行分子对接，结果见表2。这些化合物与两个基因之间的亲和能均<-20.9 kJ/mol，表明芪苈强心胶囊中的核心活性化合物与这两个基因均有非常好的结合活性。其中，与JUN亲和能较低的化合物分别为β-胡萝卜素(亲和能为-33.44 kJ/mol)、丹参酮Ⅱa(亲和能为-30.10 kJ/mol)和木犀草素(亲和能为-28.01 kJ/mol)。这些化合物与 TP53 的亲和能较低的化合物分别为丹参酮Ⅱa(亲和能为-39.29 kJ/mol)、槲皮素(亲和能为-37.20 kJ/mol)和黄芩素(亲和能为-35.95 kJ/mol)。此外，与两个蛋白之间亲和结合能较低的化合物还包括川陈皮素、β-谷甾醇、山柰酚和芒柄花黄素，为了进一步研究这些化合物与蛋白之间的相互作用，对这 9 个化合物与蛋白之间的相互作用进行进一步分析，结果见图11、图12。
表2 芪苈强心胶囊核心化合物与JUN、TP53 的结合亲和力
图11 芪苈强心胶囊中核心化合物与JUN的分子对接图
图12 芪苈强心胶囊中核心化合物与TP53的分子对接图
扩张型心肌病以慢性心力衰竭为主要临床表现，中医证候特征为虚实夹杂、本虚标实[23]。心力衰竭在中医中归于“心悸”“水肿”“喘证”等范畴，其发病机制为心肾阳虚、心气不足引起痰瘀水泛，在中医临床治疗上应着重关注活血利水、益气温阳[24]。
芪苈强心胶囊为基于络病学脉络瘀阻、气阳亏虚、水液停聚、络息成积的基本病机研发的中药复方制剂，组方中丹参、红花活血祛瘀、通经止痛；
人参补元气；
附子温阳；
黄芪补气升阳、利水消肿；
桂枝温阳化软；
陈皮理气健脾、燥湿化痰；
玉竹养阴润燥；
泽泻、葶苈子、香加皮等有利水消肿之效。诸药合用，共奏活血祛瘀、益气温阳、活血利水的功效[25]。现代药理研究表明，芪苈强心胶囊可以抑制神经内分泌的过度激活、保护血管内皮、阻断离子通道、改善心室重构及代谢重构[26]。因此，本研究采用中药复方网络药理学及分子对接技术，进一步对芪苈强心胶囊治疗扩张型心肌病中潜在的活性成分及靶点进行挖掘，并探讨其可能的作用机制。
中药复方网络药理学分析结果显示，芪苈强心胶囊中主要的活性成分包括常春藤皂苷、豆甾醇、槲皮素、异鼠李素、山柰酚、β-谷甾醇、丹参酮Ⅱa、木犀草素、谷甾醇、芒柄花黄素等。刘佳慰等[27]研究发现，常春藤皂苷具有一定的降脂作用。槲皮素能够有效地缓解自身免疫性心肌炎症状[28]。丹参酮Ⅱa、芒柄花黄素可以提高缺氧状态下心肌细胞的存活率以及ATP的含量，同时还可抑制动脉粥样硬化性单核细胞黏附和炎症，影响PPAR通路相关蛋白的表达等[29-30]。β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，能够持续降低心肌梗死病人的血清β-脂蛋白和胆固醇水平[31]。异鼠李素同样对心肌细胞损伤具有一定的保护作用[32]。另外，山柰酚可以通过抑制炎症反应和氧化应激从而减轻心脏损伤[33]。结合文献及本研究结果，说明网络药理学方法在中医药作用机制鉴定中的成功实践。同时，本研究中还有一些活性成分的心肌细胞保护作用尚未见报道，值得进一步探究。其次，通过分析调控网络中的靶点基因，最终发现靶点基因PTGS2与高度值节点JUN和TP53最为关键。研究表明，AP-1转录因子JUN可防止应激所致的心脏适应性不良重塑[34]。扩张型心肌病的小鼠模型中PTGS2水平上升[35]。研究已证实，扩张型心肌病病人的心脏组织中纤维化增加并且TP53信号通路激活[36]。TP53基因缺失部分挽救心肌纤维化、细胞凋亡、非心肌细胞增殖、左心室扩张和功能障碍，并可以轻微改善扩张型心肌病的存活率[37]。结合现有的报道与GO富集和KEGG分析结果显示，与扩张型心肌病相关的生物学过程主要有毒性反应、脂多糖、细胞外刺激、金属离子，细菌反应、氧化应激反应等，信号通路主要有人巨细胞病毒感染、流体剪应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、PI3K/Akt、MAPK、TNF等，涉及有毒物质、病毒、重金属、细菌、免疫调节及炎症等多方面的生物学效应，这与扩张型心肌病的发病原因基本一致[2]。芪苈强心胶囊中主要的活性成分分别与JUN和TP53蛋白进行分子对接，显示其结合能力强，表明芪苈强心胶囊治疗扩张型心肌病中的心肌保护作用主要通过活性成分作用于上述基因，参与调控相关信号通路，从而发挥重要作用，而进一步研究其详细的药理机制仍需相关实验研究进一步探讨与证实。
综上所述，本研究基于中药复方网络药理学与分子对接技术，以芪苈强心胶囊为研究对象，对其所含的化学成分、作用靶点及其关键药效成分与JUN和TP53的结合能力进行分析，进一步探索了芪苈强心胶囊治疗扩张型心肌病的物质基础和作用机制。本研究可以为进一步针对中药活性成分开展研发扩张型心肌病中药的筛选和评价提供数据支持和理论依据。
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