张晓慧 郭全友 包海蓉 郑 尧 杨 絮 魏帮鸿
（1上海海洋大学食品学院，上海 201306；
2中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；
3农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 200090）
鱿鱼是我国远洋渔业的重要捕捞品种之一。2020年鱿鱼的捕捞量为29.57 万吨，占头足类捕捞量的50%以上［1］。鱿鱼具有营养价值高、富含多种人体必需氨基酸的特点，是一种高蛋白、低脂肪的水产品［2］。目前，市场上流通的鱿鱼以冻品为主，但冷链贮运中温度波动大，易发生冻融现象，因此，鱿鱼丝、软烤制品及鱼糜制品等加工品在市场上的比例逐年上升［3］。鱿鱼肌肉中蛋白质含量高，肌原纤维蛋白含量占60%～70%［4］；
同时，鱿鱼鱼糜具有无腥味、组织细腻、白度值高等优点［5］，因此鱿鱼逐渐成为加工鱼糜制品的重要原料之一。
根据市场及产业调研，以鱿鱼与淡水鱼为主料，添加大豆分离蛋白、变性淀粉等添加剂制成的鱿鱼混合鱼糜制品深受消费者喜爱，如“一丸一世界”、“家豪大厨手打丸子”等品牌。鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）是我国四大淡水养殖鱼类之一，2020年产量位居第三，达到38.12 万吨［1］。白鲢鱼具有低脂、蛋白质种类丰富和价格低等特点［6］，常作为鱼糜制品的主要原料之一。但是鱿鱼体内富含内源酶，肌原纤维蛋白易发生降解，因此存在凝胶特性差的问题［7-8］，制约了鱿鱼鱼糜制品的快速发展。因此，改善鱿鱼鱼糜制品的凝胶特性十分必要。
鱼糜制品的凝胶特性受原料鱼品种、原料鱼混合比例、添加剂及加工工艺等因素影响［9］。将海水鱼与淡水鱼以适当比例混合，可改善鱼糜制品的凝胶特性，如白鲢鱼与金线鱼混合鱼糜的凝胶强度和持水性显著高于单一金线鱼糜和白鲢鱼糜［10］。Maza-Ramírez等［11］研究了鱿鱼与鳀鱼混合鱼糜的质构和色泽变化，结果表明鱿鱼与鳀鱼混合比例为7∶3 时，显著提高了混合鱼糜的凝胶强度、硬度及弹性。徐文鑫［12］研究了罗非鱼与鱿鱼添加比例对混合鱼糜制品凝胶强度、白度值及感官评价的影响，结果表明鱿鱼添加量为10%～20%时，混合鱼糜制品的凝胶品质最好。但关于鱿鱼与白鲢鱼混合鱼糜制品的凝胶特性研究仍鲜有报道。因此，本研究以鱿鱼和白鲢鱼为主料，重点分析感官评价、凝胶强度、持水性及白度等指标，结合水分分布和肌原纤维蛋白组成，观察混合鱼糜凝胶微观结构变化，旨在探究鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品凝胶特性的影响，为拓展鱿鱼资源的开发利用提供参考。
1.1 材料与试剂
白鲢鱼糜（AAA 级），洪湖市井力水产食品有限公司；
阿根廷鱿鱼，中国水产舟山海洋渔业有限公司；
食盐、猪肥膘、冷冻鸡胸肉，上海大润发有限公司；
乙酰化二淀粉磷酸酯（玉米变性淀粉）、大豆分离蛋白、蛋清蛋白、可得然胶，河南万邦化工科技有限公司；
谷氨酰胺转氨酶（transglu-taminase，TGase），泰州市东圣生物科技有限公司；
复合磷酸盐，湖北兴发化工集团有限公司；
25 mm 胶原蛋白肠衣，北京大宏利辉生物科技中心；
尿素、β-巯基乙醇（分析纯）、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）（分析纯），上海国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FP 4116型德尔绞肉机，广东阳江德尔电器有限公司；
CR-400 色彩色差仪，日本Chroma Meter 公司；
TMS-Pro 质构仪，美国Food Technology Corporation 公司；
Avanti J-301高性能离心机，美国Beckman Coulter 公司；
PQ001-20-25V 核磁共振成像仪，苏州纽迈分析仪器股份有限公司；
Bio-Rad 电泳仪，美国Bio-Rad 公司；
Olympus DP72光学显微镜，日本奥林巴斯株式会社。
1.3 试验方法
1.3.1 混合鱼糜制品基础配方 根据前期试验及工厂调研，优选混合鱼糜制品的基础配方。主料：阿根廷鱿鱼、白鲢鱼糜，总计70%，猪肥膘10%，冷冻鸡胸肉20%；
辅料（相对于主料质量计）：食盐2.5%、冰水6%、复合磷酸盐0.3%、TGase 0.5%、乙酰化二淀粉磷酸酯10%、蛋清蛋白7%、大豆分离蛋白4%、可得然胶0.2%。1.3.2 混合比例设定 将阿根廷鱿鱼与白鲢鱼分别按照1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2质量比混合。
1.3.3 混合鱼糜制品工艺流程 将白鲢鱼鱼糜和鱿鱼冷藏解冻6 h，鱿鱼去皮、去内脏、清洗切块备用，白鲢鱼糜切小块备用；
根据试验设计加入不同比例的阿根廷鱿鱼、白鲢鱼鱼糜、鸡胸肉及猪肥膘斩拌2 min后，加入2.5%食盐斩拌2 min，再加入添加剂（复合磷酸盐、TGase、乙酰化二淀粉磷酸酯、蛋清蛋白、大豆分离蛋白、可得然胶）斩拌3 min；
然后将制备好的鱼糜手动灌入胶原蛋白肠衣中并封口，进行二段式加热（40 ℃加热30 min；
90 ℃加热20 min），完成鱼糜的凝胶化过程后，立即放入冰水中冷却30 min；
最后放入4 ℃冰箱冷藏过夜，测定指标。
1.3.4 感官评价 参考《NY/T 1327-2018 绿色食品鱼糜制品》［13］并稍作调整，由10 位经过感官评定培训的人员（5 名男性、5 名女性）组成品评小组，从组织形态、色泽、滋味、质地、气味5个方面进行评价，评定标准见表1。采用加权法计算总分，各项指标取平均值。
表1 鱼糜制品感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of surimi products
1.3.5 凝胶强度的测定 参考Yi等［14］的方法并稍作修改。测定前将过夜放置的样品剥去肠衣，于室温放置30 min，切割成高20 mm、直径25 mm 的圆柱体，通过TMS-Pro 质构仪测量其凝胶强度。参数设定：探头型号为TA 43；
测试前速度为60 mm·min-1；
测试速度为60 mm·min-1；
测试后速度为60 mm·min-1；
穿刺距离为15 mm；
触发力为1.0 N。
1.3.6 白度的测定 参考Liang 等［15］的方法，将混合鱼糜凝胶切片至3 mm 厚，使用色差仪测量L*、a*和b*值。白度值按公式（1）计算：
式中，L*：亮度值；
a*：红绿值；
b*：黄蓝值。
1.3.7 水分分布的测定 参考余永名等［10］的方法并稍作修改。取10 mm×10 mm×20 mm（重1.80±0.01 g）的圆柱体放入PQ001-20-25V 核磁共振成像仪中，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列进行自旋-自旋弛豫时间（T2）的测定。参数设定：共振频率（spectrometer frequency，SFI）=22 MHz，90°脉宽（pulse 90°，P90）=6.40 μs，采样频率（sampling bandwidth，SW）=200 kHz，重复采样等待时间（time wait，TR）=1 500 ms，累加次数（number sampling，NS）=8，射频时间（regulate first data，RFD）=200 μs，回波个数（number of echoes，NECH）=5 000。
1.3.8 持水性的测定 参考徐安琪等［16］的方法。准确称取3 g混合鱼糜凝胶样品（W1），置于2层滤纸间包裹好，5 000 r·min-1、4 ℃条件下离心15 min，立即取出样品称其质量（W2）。按照公式计算持水性：
1.3.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electroph-oresis, SDS-PAGE）的测定 参考徐安琪等［16］的方法并稍作修改。取混合鱼糜凝胶2 g 于离心管中，加10 倍量20 mmol·L-1Trismaleate 缓冲液（含0.05 mol·L-1KCl，pH 值7.0），匀浆后冷冻离心（10 000 r·min-1，4 ℃，10 min），沉淀加入10 倍量20 mmol·L-1Tris-maleate 缓冲液（含0.6 mol·L-1KCl，pH 值7.0），充分匀浆，静置1 h 后10 000 r·min-1冷冻离心10 min，上清液即为肌原纤维蛋白溶液。采用双缩脲试剂法测定肌原纤维蛋白含量。
调节肌原纤维蛋白浓度至3.0 mg·mL-1，与上样液以1∶4 的比例混合均匀，沸水浴5 min，上样10 μL，Marker 上样5 μL，恒压200 V 电泳。取出胶片用考马斯亮蓝染色1 h（100 mL染色液含有0.25 g考马斯亮蓝R 250，甲醇45 mL，冰醋酸10 mL），然后用脱色液脱至透明（30%甲醇、10%乙酸、60%超纯水，v/v），最后在凝胶成像仪上成像。
1.3.10 凝胶微观结构的测定 参考Mehta 等［17］的方法并稍作修改。将混合鱼糜制品切成4 mm×4 mm×4 mm 的正方体，用卡诺氏固定液（60%无水乙醇、30%三氯甲烷、10%冰醋酸，v/v）固定24 h，去除固定液，用乙醇溶液（70%～100%，v/v）梯度脱水，包埋在石蜡块，切片4 μm，苏木素-伊红染色后用光学显微镜观察。
1.4 数据处理
每个样品测3～5个平行，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 26.0 软件进行数据统计分析，采用单因素ANOVA 检验和Duncan 检验，检测限为0.05，当P＜0.05时，表示差异显著。利用Origin 2021软件制图。
2.1 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品感官质量评分的影响
由表2 可知，鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品感官质量评分影响显著（P＜0.05）。随着鱿鱼添加比例的增加，滋味、气味评分增加，可能是因为白鲢鱼带有土腥味及鱼腥味，影响了鱼糜制品整体的滋味及气味［18］；
而组织形态、色泽、质地评分都呈先上升后下降的趋势，并在鱿鱼与白鲢鱼混合比例为3∶4 时达到最大值。当混合比例为3∶4 时，鱼糜制品感官评分总分显著高于其余四组（P＜0.05），表明该比例下鱼糜制品组织致密、切片光滑且色泽均匀、有光泽，带有鱿鱼特有风味，口感较好。
表2 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品感官质量评分的影响Table 2 Effect of mixing ratio of squid and silver carp on sensory quality score of surimi products
2.2 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品凝胶强度和持水性的影响
凝胶强度和持水性是评价鱼糜制品品质的重要参数。持水性表示鱼糜凝胶网络对其本身水分的束缚能力，在一定程度上反映了鱼糜凝胶中蛋白质-水及蛋白质之间相互作用的程度［19］。一般而言，持水性越高，表明鱼糜凝胶网络结构越致密，凝胶强度越大［20］。由图1 可知，随着鱿鱼添加比例的增加，鱼糜制品的凝胶强度和持水性呈先上升后下降的趋势。其中，混合比例为1∶6 和2∶5 组之间的凝胶强度和持水性无显著性差异（P＞0.05）；
混合比例为3∶4 时，鱼糜制品的凝胶强度和持水性达到最大值，分别为2 351.29 g·mm 和95.11%；
混合比例为5∶2 时，鱼糜制品的凝胶强度和持水性显著低于其余四组（P＜0.05）。综上，鱿鱼与白鲢鱼混合比例为3∶4 时，鱼糜制品的凝胶强度和持水性较好。
图1 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品凝胶强度和持水性的影响Fig.1 Effect of mixing ratio of squid and silver carp on the gel strength and water holding capacity of surimi products
2.3 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品色泽的影响
白度作为评价鱼糜制品的重要指标之一，直接影响消费者对产品的感官评价。由表3 可知，随着鱿鱼添加比例的增加，白度值呈先升后降的趋势，而L*、a*和b*呈上升趋势。其中，混合比例为4∶3 和5∶2 时，鱼糜制品的L*高于其余三组（P＜0.05），可能是因为鱼糜制品中鱿鱼比例较高，且肌肉颜色较白，影响了鱼糜制品的亮度。混合比例为3∶4时，鱼糜制品的白度最高，这与感官质量评分中色泽评分的结果一致，说明该比例下，鱼糜制品具有更好的色泽，更易被消费者接受。
表3 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品白度值的影响Table 3 Effect of ratio of squid and silver carp on the whiteness of surimi products
2.4 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品水分分布的影响
低场核磁共振技术是在不破坏凝胶网络结构的情况下，评估凝胶体系中各类水分子的迁移和分布情况的方法［21］。由图2 可知，鱼糜制品水分存在4 个T2区间，分别为T21（0.1～1 ms）、T2b（1～10 ms）、T22（10～100 ms）、T23（100～1 000 ms），其中T21和T2b为结合水，表示与蛋白质等大分子结合较紧密的水；
T22为不易流动水，即束缚在凝胶微观网络结构中的水分；
T23为自由水，表示可以在凝胶网络外自由流动的水分。鱼糜制品中不易流动水占比最高，结合水次之，自由水最少。随着鱿鱼添加比例的增加，T2b弛豫时间整体向右偏移，表明结合水转变成不易流动水；
T23弛豫时间先向左偏移，表明自由水转变成不易流动水；
混合比例为3∶4时，T23弛豫时间向右偏移，表明不易流动水变成自由水。
图2 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品横向弛豫时间T2的影响Fig.2 Effect of mixing ratio of squid and silver carp on T2 transverse relaxation time of surimi products
横向弛豫时间T2代表氢质子与其他非水组分结合紧密程度，弛豫时间越短，结合越紧密，即水分的流动性越差；
峰面积比例P2代表对应水分的相对含量，P2i越大，相对含量越高［22］。由图3可知，随着鱿鱼添加比例的增加，T22（不易流动水）横向弛豫时间呈先减小后增大的趋势，而P22变化趋势与之相反。其中，混合比例为1∶6 和2∶5 时，鱼糜制品的T22弛豫时间有显著差异（P＜0.05）；
混合比例为3∶4 时的T22弛豫时间显著低于其余四组（P＜0.05），说明该比例下，鱼糜制品的水分流动性差，被束缚在凝胶网络中。随着鱿鱼添加比例的增加，P22峰面积比例整体呈先升高后下降的趋势，表明不易流动水的相对含量发生了变化；
混合比例为3∶4时，P22峰面积比例最大，不易流动水相对含量最高，即鱼糜凝胶网络中的水分最多。通过低场核磁共振的T2弛豫时间分布、P22弛豫时间和峰面积比例的综合分析，本研究认为鱿鱼与白鲢鱼比例为3∶4时，凝胶网络中水分迁移和分布有利于提高鱼糜制品的凝胶品质。
图3 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜制品横向弛豫时间T22和峰面积比例的影响Fig.3 Effect of mixing ratio of squid and silver carp on T22 transverse relaxation time and peak area proportion of surimi products
2.5 鱼糜制品肌原纤维蛋白的SDS-PAGE分析
由图4 可知，鱼糜制品的肌原纤维蛋白主要包括肌球蛋白重链（myosin heavy chains，MHC）、肌动蛋白（actin，AC）及肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）。其中，肌球蛋白重链对鱼糜的凝胶能力起主要作用［23］；
肌动蛋白对凝胶网络的形成作用较小［24］；
而肌球蛋白轻链可能与蛋白质的降解有关［25］。当鱿鱼与白鲢鱼比例为3∶4 时，肌球蛋白重链条带几乎消失，可能是由肌球蛋白重链发生交联，大分子聚合物不能进入电泳凝胶中所致；
当比例为5∶2时，肌球蛋白重链条带也较浅，结合凝胶强度和持水性的结果分析，原因可能是鱼糜制品中的蛋白水解酶降解肌球蛋白重链，导致其含量较低，条带颜色较浅。
图4 鱼糜制品肌原纤维蛋白的SDS-PAGE图Fig.4 SDS-PAGE patterns of myofibrillar proteins from surimi products
2.6 鱼糜凝胶微观结构的分析
鱼糜凝胶的微观结构与鱼糜制品的凝胶强度和持水性相关［26-27］。由图5 可知，随着鱿鱼添加比例的增加，鱼糜凝胶的网络结构变化并不明显，可能是因为鱼糜制品中的大豆分离蛋白、变性淀粉等添加剂对凝胶网络的作用较大，导致鱿鱼与白鲢鱼比例变化对凝胶网络的影响不明显。当鱿鱼与白鲢鱼混合比例为3∶4和4∶3 时，混合鱼糜凝胶网络相对来说都表面孔洞较小且少，分布相对均匀，形成了相对致密的凝胶网络结构；
但当混合比例为5∶2 时，与其他组相比，存在多个孔洞且分布不均，说明在该比例下，鱼糜凝胶网络对水分的束缚能力极差。
图5 鱿鱼与白鲢鱼混合比例对鱼糜凝胶微观结构的影响Fig.5 Effect of mixing ratio of squid and silver carp on the microstructures of surimi gels
鱼糜的凝胶结构是由肌原纤维蛋白（肌动蛋白、肌球蛋白）变性形成的网状结构［28］。鱼糜凝胶的形成过程包括三个阶段：一是凝胶化，即50 ℃以下的温度域，肌原纤维蛋白高级结构受热发生松散，分子间产生架桥形成三维的网状结构，分子之间的架桥与二硫键、疏水基团有关［29］；
二是凝胶劣化，指在70 ℃以下温度域，已形成的凝胶结构逐渐劣化、崩溃，凝胶劣化可能与鱼种不同而导致的内源性蛋白酶活性不同有关［28］；
三是形成鱼糕，是70 ℃以上的温度域，肌原纤维蛋白形成的凝胶网络被固定，鱼糜凝胶网络结构中的水分被束缚，形成具有弹性的鱼糕［9］。因此，结合鱼糜凝胶结构形成的过程，鱿鱼鱼糜制品凝胶特性变化可能与两种鱼肉加热时肌动球蛋白疏水基团暴露程度、内源性TGase 及蛋白水解酶等影响肌原纤维蛋白之间的交联有关［30］。
鱼糜凝胶化过程中，内源性TGase 诱导的氢键、疏水相互作用、二硫键等是蛋白质形成聚合物的主要化学作用力［31］。Abdollahi 等［32］在研究黑海棱鲱/白鲢鱼混合鱼糜凝胶强度和持水性增强时指出，加热导致更多的疏水基团暴露，并通过二硫键相互连接，形成大分子聚集体，促进了鱼糜凝胶网络的形成，使其更好地锁水。Yi 等［14］发现白鲢鱼和金线鱼的混合比例对鱼糜凝胶的蛋白质构象有影响，加热导致混合鱼糜凝胶的α-螺旋转化为β-折叠，混合鱼糜蛋白质的重新排列导致二硫键和疏水相互作用发生变化，从而影响鱼糜的凝胶网络结构。本研究中，随着鱿鱼添加比例的增加，鱼糜制品的凝胶强度和持水性呈先上升后下降的趋势，可能是由于前期部分鱿鱼和白鲢鱼混合鱼糜肌原纤维蛋白受热变性，使鱼糜制品的蛋白二级结构发生改变，大量疏水基团暴露，诱导二硫键的形成，增强了鱼糜凝胶网络的持水性和凝胶强度；
后期大量添加鱿鱼后，鱿鱼体内存在大量活性较高的蛋白酶［33］，导致肌原纤维蛋白发生降解，影响了混合鱼糜蛋白质之间的相互作用，进而使鱼糜凝胶网络的持水性和凝胶强度下降，这也与余永名等［10］研究金线鱼/白鲢鱼混合比例对鱼糜凝胶的凝胶强度和持水性影响的结果一致。
本试验中，当鱿鱼和白鲢鱼混合比例为3∶4 时，鱼糜制品的白度值较大且持水性较高，表明白度的变化可能与鱼糜制品形成的凝胶网络相关。这与Liu等［34］研究鳕鱼糜与白鲢鱼糜混合鱼糜制品持水性与白度值变化趋势的结果一致。鱼糜制品的微观结构反映了鱼糜凝胶网络的致密程度，一定程度上会影响鱼糜凝胶的持水性和水分分布，进而反映鱼糜凝胶强度的变化［19］。Núñez-Flores 等［35］研究表明，混合鱼糜微观结构的改变可能是因为两种鱼糜的氨基酸组成发生了变化，特别是精氨酸和赖氨酸，促进了肌球蛋白的扩张，从而增强了蛋白质之间的聚合作用，影响了鱼糜的微观结构，进而导致凝胶强度发生变化。本研究结果表明，鱿鱼与白鲢鱼混合比例为3∶4 时，鱼糜凝胶网络结构相对较致密均一，推测是因为鱿鱼和白鲢鱼蛋白质中氨基酸的组成和含量不同，导致蛋白质分子之间的相互作用增强，形成的大分子聚合物填充了凝胶中的结构空洞，使混合鱼糜凝胶网络更加紧密，对水分子的束缚能力更强［14］。然而，本试验仅对鱿鱼/白鲢鱼鱼糜制品的凝胶特性进行了分析，对于鱿鱼与白鲢鱼混合鱼糜凝胶的肌原纤维蛋白交联的作用机制还需进一步深入探究。
不同混合比例的鱿鱼与白鲢鱼因鱼种之间的肌原纤维蛋白发生交联，对鱼糜制品的凝胶特性产生了影响。当鱿鱼与白鲢鱼混合比例为3∶4 时，凝胶特性最好，这与混合鱼糜蛋白质之间的相互作用有关；
且该比例下的鱼糜制品的持水性和白度值高于其余混合比例；
横向弛豫时间最短，不易流动水含量更多，鱼糜的凝胶网络更加致密。综上，鱿鱼与白鲢鱼混合比例为3∶4时可明显改善混合鱼糜制品的凝胶品质。