何 涛，孔德强，韩雪飞，索志超，高倩兰，吕金梅
（廊坊市人民医院a.神经内科；
b.检验科，河北廊坊 065000）
缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke）是一种由脑血管狭窄或闭塞引起的神经系统疾病，发病率及致死率均较高，也是导致长期残疾的第一大原因[1]。缺血性脑卒中约20%～30%病例归因于同侧颈动脉斑块，颈动脉支架成形术（carotid artery stenting，CAS）已被认为是治疗颈动脉狭窄患者的安全有效方法[2]。然而术后的支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）问题仍较为严重且有待解决。因此，探究与ISR发生发展相关的分子机制对于预防ISR，提高CAS的治疗疗效有重要意义。趋化因子受体5（chemokine receptor 5，CCR5）位于3号染色体短臂21位，记为3p21，是一种G蛋白偶联受体，参与将白细胞募集到组织损伤部位，其不仅在免疫细胞中表达，还在神经元、神经胶质和血管细胞等脑细胞中表达[3]。基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）又称为CXCL12，是一种与两种受体蛋白趋化因子受体（CXCR）4和CXCR7结合的趋化因子蛋白，能够调节各种生物过程，包括炎症反应、血管形成、神经发育等[4]。有研究显示缺血性脑卒中患者血清SDF-1，CCR5信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）水平增加[3,5]。然而CCR5和SDF-1 mRNA与缺血性脑卒中患者行CAS后发生ISR的关系还未有报道。本研究采用实时荧光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）技术检测缺血性脑卒中患者CAS术前血清CCR5和sDF-1 mRNA水平，探究缺血性脑卒中患者外周血中是否存在显著性差异的基因，分析二者在CAS后ISR发生机制中的作用，进而为减少ISR的发生风险及其诊治提供理论依据。
1.1 研究对象 选取廊坊市人民医院2019年6月～2021年1月成功行CAS的缺血性脑卒中患者158例，其中男性91例，女性67例，年龄49～77（67.71±7.95）岁，身体质量指数（body mass index, BMI）18.83 ～ 28.59（23.02±2.26）kg/m2。纳入标准：①患者均符合缺血性脑卒中诊断标准[6]；
②经头颈部CT血管造影（CT angiography，CTA）或数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）提示颈动脉狭窄，符合CAS手术指征[7]，并成功行该手术；
③术前3天及术后接受用药，且用药情况一致，支架材料一致。排除标准：①入组前三个月有免疫抑制剂或抗生素使用史；
②并发心肌梗死；
③出血性脑梗死；
④既往有CAS史；
⑤凝血功能障碍；
⑥失访患者；
⑦发生颅内感染或大面积梗死。本研究患者及家属签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准（批准号LS2019-3-2）。
1.2 仪器与试剂 全自动生化分析仪（型号AU5800，美国贝克曼库尔特公司），微量核酸蛋白分析仪（型号Nano-600），荧光定量PCR仪（Cycler 480，上海嘉鹏科技有限公司）；
RNA提取试剂盒（批号：19241ES50，上海翌圣生物科技股份有限公司），PCR试剂盒（批号：17ES603，上海翌圣生物科技股份有限公司）；
逆转录酶（批号：FSQ-201，上海东洋纺生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 临床资料收集：收集患者一般人口学资料、基础疾病史、CAS术前实验室指标[白细胞计数（white blood cell count，WBC）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）]。
1.3.2 血清CCR5，SDF-1 mRNA表达水平的检测：患者入院后CAS术前抽取空腹外周血5 ml，离心取血清，使用RNA提取试剂盒从血清中得到总RNA，然后通过微量核酸蛋白分析仪检测RNA质量和浓度，挑选合格的样品，吸取2 μg RNA按照逆转录酶说明书得到cDNA，然后使用PCR试剂盒配制成10 μl反应体系，并在荧光定量PCR仪上采集信号。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，具体序列均列于表1。CCR5，SDF-1均以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt法计算CCR5 和 SDF-1 mRNA的表达水平。
表1 引物序列
1.3.3 术后随访：术后一年患者行头颈部CTA或DSA复查，根据复查结果判断是否发生ISR，随访截止时间2022年1月。管腔直径较CAS后缩小30%及以上为有ISR，管腔直径较CAS后缩小50%及以上为明显的ISR[7]。本研究中ISR定义为管腔直径缩小30%及以上。根据CAS后一年有无ISR将158例患者分为ISR组（n=30）和非ISR组（n=128）。
1.4 统计学分析 采用SPSS24.0软件分析数据，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，行t检验，计数资料以n（%）表示，行χ2检验；
Pearson法分析血清CCR5，SDF-1 mRNA表达水平与管腔直径缩小率的相关性；
Logistic回归分析缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的影响因素；
受试者工作特征（ROC）曲线分析血清CCR5，SDF-1 mRNA表达水平对缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的预测价值，曲线下面积（AUC）比较采用Z检验；
P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 ISR组和非ISR组临床资料比较 见表2。ISR组和非ISR组年龄、性别、身体质量指数、吸烟、饮酒、高脂血症、高血压、WBC，HbA1c，Hcy，TC，TG和HDL-C比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；
ISR组糖尿病比例、LDL-C水平高于非ISR组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。
表2 ISR组和非ISR组临床资料比较 [（±s），n（%）]
表2 ISR组和非ISR组临床资料比较 [（±s），n（%）]
项目 ISR组（n=30） 非ISR组（n=128） t/χ2值 P值年龄（岁） 68.23±7.50 67.59±8.05 0.397 0.692性别（男/女） 18/12 73/55 0.088 0.767身体质量指数（kg/m2） 23.38±2.65 22.94±2.17 0.957 0.340吸烟 16（53.33） 70（54.69） 0.018 0.893饮酒 13（43.33） 56（43.75） 0.002 0.967高脂血症 12（40.00） 48（37.50） 0.064 0.800糖尿病 19（63.33） 55（42.97） 4.048 0.044高血压 15（50.00） 61（47.66） 0.053 0.817 WBC（×109/L） 6.52±1.84 7.06±2.65 1.057 0.292 HbA1c（%） 5.83±1.19 5.64±0.96 0.930 0.354 Hcy（μmol/L） 14.70±4.26 14.38±4.75 0.338 0.736 TC（mmol/L） 3.95±0.82 3.61±0.94 1.824 0.070 TG（mmol/L） 1.44±0.39 1.38±0.27 0.975 0.331 HDL-C（mmol/L） 1.76±0.53 1.59±0.48 1.711 0.089 LDL-C（mmol/L） 2.57±0.46 2.15±0.34 5.668 0.000
2.2 ISR组和非ISR组血清CCR5，SDF-1 mRNA表达水平比较 ISR组血清CCR5（1.24±0.22），SDF-1 mRNA（1.32±0.22）表达水平高于非ISR组（0.97±0.15，1.00±0.12），差异有统计学意义（t=8.233,10.786，均P<0.05）。
2.3 血清CCR5，SDF-1 mRNA表达水平与管腔直径缩小率的相关性分析 非ISR组管腔直径缩小率为（22.65±4.59）%，而ISR组管腔直径缩小率为（39.50±7.27）%，两组间差异有统计学意义（t=15.993，P=0.000）。血清CCR5和SDF-1 mRNA表达水平均与术后一年管腔直径缩小率呈正相关（r=0.516，0.583，P=0.014，0.008）。
2.4 影响缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的多因素分析 见表3。将上述差异有统计学意义的变量（糖尿病、LDL-C，血清CCR5，SDF-1 mRNA）纳入多因素Logistic回归分析，结果显示糖尿病、CCR5和SDF-1 mRNA是影响缺血性脑卒中患者行CAS后发生ISR的危险因素（均P<0.05）。
表3 影响缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的多因素分析
2.5 血清CCR5，SDF-1 mRNA表达水平对缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的预测价值 见图1和表4。ROC曲线结果显示，血清CCR5，SDF-1 mRNA和二者联合预测缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的AUC分别为0.848，0.912和0.956；
二者联合预测优于血清CCR5，SDF-1 mRNA单独预测（Z=2.192，2.494，P=0.028，0.013）。
表4 血清CCR5，SDF-1 mRNA表达水平对缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的预测价值
图1 血清CCR5，SDF-1 mRNA表达水平预测缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的ROC曲线
脑卒中在全球死因中排名第二，每年发生病例超过1 300万例，每年约有550万人死于该病，生存者中约50%会导致永久性残疾，而缺血性脑卒中占脑卒中病例的80%左右[8-9]。目前，CAS已经成为治疗缺血性脑卒中的重要方案，然而其术后ISR的发生率为2.70%～33%，导致复发性脑卒中和神经系统疾病风险增加[10]。ISR是一种异常的伤口愈合反应，或血管重建过程中动脉对创伤适应的不良反应，主要由新内膜增生和血管重塑过程的相互作用引起，由于手术或血管内操作，血管内皮继发性损伤后平滑肌细胞增殖、迁移，血管外基质重构，同时支架植入后形成局部慢性炎症，促使炎性细胞聚集、活化，促进炎症因子释放，使血管内膜增厚，继而诱发ISR[10-11]。
炎症反应是脑缺血后的一个关键级联行为，旨在通过免疫细胞在生理条件下释放的细胞因子帮助清除受损组织并促进突触重建，而脑卒中后持续的炎症活动可能会加剧神经组织的损伤[12]。CCR5是一种趋化因子受体，属于整合膜蛋白的β趋化因子受体家族，在外周血白细胞中表达，其主要通过加重炎症反应来发挥作用。神经系统发生病变时，内皮细胞大量分泌CCR5 CC趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）3，CCL4和CCL5，激活CCR5，配体与受体结合，免疫细胞透过血脑屏障，聚集到损伤区域，加重炎症反应[13-14]。有研究显示CCR5的过表达能够有助于内皮祖细胞归巢到受损的内皮细胞，促进内皮修复，改善内皮功能障碍[15]。陈增光等[16]研究发现颈动脉狭窄患者外周血CD4+T细胞CCR5表达水平显著高于颈动脉正常者，CD4+T细胞CCR5表达水平增加与颈动脉狭窄相关。何宏媛等[17]研究发现，脑缺血后CCR5能够促进中性粒细胞向缺血部位聚集，从而加重缺血后损伤。既往研究显示，疾病状态下CCR5 mRNA和蛋白水平具有一致性，如间歇性缺氧可诱导THP-1细胞中CCR5 mRNA和蛋白水平增加[14]，实验性牙周炎大鼠牙周组织中CCR5 mRNA和蛋白水平增加[18]。由于检测CCR5 mRNA水平更能从分子生物学角度分析患者ISR的发生机制，故而本研究采用qRTPCR技术研究血清CCR5 mRNA表达变化。本研究发现，ISR组血清CCR5 mRNA表达水平较非ISR组升高，且CCR5 mRNA与患者术后一年管腔直径缩小率呈正相关，表明CCR5参与ISR病理过程，有望成为预测ISR的重要分子标记物。原因可能是由于持续炎症反应将CCR5吸引到动脉壁，在CCR5的引导下，CD4+T细胞迁移到病灶中放大炎症反应，促进动脉粥样硬化及斑块形成，同时促进内膜增生，进而引起ISR。
基质细胞衍生因子-1（SDF-1）是一种在中枢神经系统普遍表达的趋化因子蛋白，可通过调节造血干细胞等进入血管活跃区，影响血管新生和侧支循环，与动脉粥样硬化等心血管疾病密切相关[19]。KONTOS等[20]研究发现，脑组织缺血会诱导SDF-1上调表达，SDF-1与CXC趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）结合后诱导缺血微环境中炎症因子分泌增加，导致脑组织损伤加重。高靖等[21]研究表明血清SDF-1在急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者中异常上调，SDF-1的高表达与AIS患者病情严重程度呈正相关，预后良好者血清SDF-1水平低于预后不良患者。欧鲤娴等[22]研究表明，缺血性脑卒中患者血清SDF-1水平与血管狭窄程度呈正相关，还与动脉粥样硬化风险的增加密切相关。张燕楠等[5]采用qRT-PCR技术检测到SDF-1 mRNA在脑梗死患者血清中上调表达，且与斑块积分、颈总动脉内膜中层厚度相关。为了探究SDF-1参与ISR的调控机制，本研究同样通过qRT-PCR技术检测SDF-1 mRNA水平，结果显示，与非ISR组相比，ISR组患者血清SDF-1 mRNA表达水平升高。进一步分析血清SDF-1 mRNA表达水平与患者术后一年管腔直径缩小率的相关性，结果显示二者呈正相关。提示SDF-1 mRNA可能在ISR病理机制中发挥一定作用，SDF-1可能成为参与ISR发生的重要标志物之一。推测脑缺血引起SDF-1表达增加，SDF-1通过与其他受体结合，调节细胞的定向转移和趋化性，导致血液黏滞性及凝固性增加，处于血栓前状态，进而在炎症过程及颈动脉粥样硬化中发挥作用；
同时SDF-1介导局部炎症反应，增加细胞周期蛋白依赖性激酶活性，促进细胞增殖，进而使血管内壁增粗狭窄[4]。此外，本研究还发现CCR5，SDF-1 mRNA是影响缺血性脑卒中患者行CAS后发生ISR的危险因素，提示CCR5和SDF-1表达水平升高可增加ISR风险，及时动态监控二者水平有助于及早防治ISR。本研究进一步采用ROC曲线分析，血清CCR5和SDF-1 mRNA预测缺血性脑卒中患者CAS后发生ISR的AUC分别为0.848，0.912，二者联合预测的AUC为0.956，优于单独预测效能，该结果可为临床缺血性脑卒中患者行CAS后ISR的发生早期预测提供参考。
综上所述，缺血性脑卒中患者CAS后ISR患者术前血清CCR5，sDF-1 mRNA表达水平均较高，并且是ISR发生的危险因素，二者联合对CAS后发生ISR的预测价值较高，对临床早期预测ISR，尽早治疗有一定应用价值。然而，本研究纳入的样本量较小，分析结果可能存在偏差，并且CCR5，SDF-1 mRNA调控ISR发生的具体机制尚不清楚，我们将继续开展多中心、大样本探究。
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