鲁硕君 田国防 李春青
河南省新乡市中心医院 453000
食管癌(Esophageal cancer，EC)发病率占据我国全部恶性肿瘤的第6位，其主要特点为恶性程度高、预后差，术后患者5年生存率为25%～40%，EC早期缺乏特异性体征，部分患者确诊时已处于中晚期，手术、放化疗等可减轻肿瘤负荷，但复发率高，因而从分子层面寻找EC发生发展相关基因/蛋白对早期诊断、监测疾病进展具有重要意义[1]。连接蛋白4(Nectin-4)是一种免疫球蛋白分子，可维持细胞间黏附力，改善细胞骨架肌蛋白，促进板状/丝状伪足生成，进而促进肿瘤细胞侵袭，研究表明Nectin-4在EC组织中呈高表达，且与肿瘤分期、转移密切相关[2]。核糖体结合蛋白1(RRBP1)属于内质网膜蛋白，可参与蛋白转运、分泌过程，已知RRBP1在EC中表达量增高，且与淋巴结转移、预后不良有关[3]。消退素D1(RvD1)具有抗炎、抗氧化作用，可抑制软骨寡聚基质蛋白(COMP)分泌，进而抑制肝细胞癌细胞生长、转移[4]。Nectin-4、RRBP1、RvD1表达变化与食管癌发生发展相关性仍需进一步探讨，本研究观察了EC组织中Nectin-4、RRBP1、RvD1表达量，分析其与临床病理特征的相关性，为临床治疗EC提供参考依据。
1.1 一般资料 选取2020年4月—2022年5月本院收治的94例EC患者为研究组，选取同期47例食管良性病变患者(食管炎13例、食管溃疡20例、Barrett食管14例)作为病变组。研究组：男56例、女38例，年龄46～68(56.19±2.41)岁，体质量指数20～25(23.24±0.56)，淋巴结转移：有38例、无56例；
肿瘤类型：浸润型34例、溃疡型28例、髓质型22例、蕈伞型10例；
肿瘤发生位置：食管上段22例、中段53例、下段19例；
分化程度[5]：低分化15例、中分化40例、高分化39例；
TNM分期[6]：Ⅰ期31例、Ⅱ期36例、Ⅲ期27例。病变组：男27例、女20例，年龄48～70(57.02±2.55)岁，体质量指数20～26(23.10±0.51)。各组一般资料比较无明显差异(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者及其家属知情且签署知情同意书。
1.2 选择标准 纳入标准：经病理学诊断确诊为EC；
临床资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤者；
合并严重感染者；
重要脏器病变者。
1.3 方法
1.3.1 采集组织样本：手术时切除EC组织、癌旁组织(病灶>5cm处)，病变组患者经组织病理学检查时切除部分组织。
1.3.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织样本中Nectin-4、RRBP1、RvD1 mRNA表达量：采用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取组织总RNA，吸取2μl RNA检测RNA浓度，主要观察RNA的A260/A280比值，比值处于1.6～1.8之间RNA纯度较高。采用反转录试剂盒(北京天根生化)合成cDNA，qRT-PCR反应体系(北京天根生化)：cDNA 2μl，Real-Time Master Mix 10μl，正反向引物各1μl，RNase-Free ddH2O补足体系至20μl；
反应条件：95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，72℃ 30s(循环40次)。以2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。上海生工生物工程公司设计引物，Nectin-4正向引物5’-CAAAATCTGTGGCACATTGG-3’，反向引物5’-GCTGACATGGCAGACGTAGA-3’；
RRBP1正向引物5’-TGAATCCTCCAAAGACCACA-3’，反向引物5’-CTTTCCCTCTCGCGTCTCT-3’；
RvD1正向引物5’-CACGCATATACCCGC-3’，反向引物5’-AAGGCGGTCTTAGCCTC-3’；
GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。
1.4 观察指标 (1)分析组织样本、不同病理特征患者中Nectin-4、RRBP1、RvD1表达量，分析其与病理特征相关性。(2)分析各指标对EC诊断价值，及其对EC发生的危险度。
2.1 不同组织中Nectin-4、RRBP1、RvD1 mRNA表达量 EC组织、病变组织中Nectin-4、RRBP1 mRNA表达量高于癌旁组织，且EC组织高于病变组织，RvD1 mRNA表达量低于癌旁组织，且EC组织低于病变组织(P<0.05)，见表1。
表1 不同组织中Nectin-4、RRBP1、RvD1 mRNA表达量
2.2 不同病理特征EC患者中Nectin-4、RRBP1、RvD1 mRNA表达量比较 伴有淋巴结转移患者Nectin-4、RRBP1 mRNA表达量高于无淋巴结转移患者，RvD1 mRNA表达量低于无淋巴结转移患者；
低分化患者Nectin-4、RRBP1 mRNA表达量>中分化>高分化，低分化患者RvD1 mRNA表达量<中分化<高分化；
Ⅰ期患者Nectin-4、RRBP1 mRNA表达量<Ⅱ期<Ⅲ期，Ⅰ期患者RvD1 mRNA表达量>Ⅱ期>Ⅲ期(P<0.05)，见表2。
表2 不同病理特征EC患者中Nectin-4、RRBP1、RvD1 mRNA表达量比较
2.3 Nectin-4、RRBP1、RvD1与病理特征相关性分析 Nectin-4、RRBP1与淋巴结转移、TNM分期呈正相关，且与分化程度呈负相关(P<0.05)；
RvD1与淋巴结转移、TNM分期呈负相关，且与分化程度呈正相关(P<0.05)，见表3。
表3 Nectin-4、RRBP1、RvD1与病理特征相关性分析
2.4 ROC分析Nectin-4、RRBP1、RvD1对EC的诊断价值 以EC患者癌组织(94例)、癌旁组织(94例)分别作为阳性样本、阴性样本，绘制ROC曲线，结果显示，联合诊断EC的AUC大于单项诊断(P<0.05)，见表4。
表4 ROC分析Nectin-4、RRBP1、RvD1对EC的诊断价值
2.5 Nectin-4、RRBP1、RvD1对EC发生的危险度分析 以2.4结果中cut-off值为界，EC患者分为高表达、低表达，结果显示Nectin-4、RRBP1高表达患者发生EC的危险度分别是低表达患者的1.636、1.491倍；
RvD1低表达患者发生EC的危险度是高表达患者的1.751倍(P<0.05)，见表5。
表5 Nectin-4、RRBP1、RvD1对EC发生的危险度分析
EC发生属于渐进过程，炎性因子产生、炎性增生直至不典型增生，随着病情发展最终形成EC，肿瘤形成过程中几个阶段相互重叠增加区分难度，因而EC早期诊断、监测病情进展成为改善患者预后的关键[7]。
Nectin-4可介导上皮—间质转化(EMT)，降低细胞间黏附力，增强细胞活动性，进而促进肿瘤细胞转移，近年来研究显示，Nectin-4在胃癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达，且与肿瘤TNM分期、分化程度有关[8]。本研究结果显示，EC组织中Nectin-4表达量高于癌旁组、病变组，且与淋巴结转移、TNM分期呈负相关，且与分化程度呈正相关，这与上述文献报道中Nectin-4作用效果相似[8]。Nectin-4可与细胞膜表面受体/黏附分子共同作用，调节肿瘤细胞增殖、迁移[9]。这就表明Nectin-4可与其他细胞黏附因子相互作用，调节细胞生长、运动，对EC发生、转移具有一定促进作用。乳腺癌组织中Nectin-4阳性表达且表达量升高，其与肿瘤病理类型密切相关，且与乳腺癌化疗效果有关，可能作为乳腺癌诊疗的潜在标记物[10]。由此推测，Nectin-4可能作为诊断EC的分子标志物。本研究结果显示，EC组织中Nectin-4表达量>4.07时敏感度、特异度分别为62.77%、72.34%，表明单独检测存在假阳性/假阴性，提示多项标记物联合检测可能提高诊断价值。
RRBP1是由膜结合、核糖体结合、酸性卷曲螺旋末端结构域构成，其与未折叠蛋白反应(UPR)信号途径相关蛋白相互作用，增强细胞增殖能力，保护肿瘤细胞免受氧化应激损伤，研究表明，RRBP1在肺癌等多种恶性肿瘤组织中表达量升高，且与患者预后不良有关[11]。本研究结果显示，EC组织中RRBP1表达量升高，且随着淋巴结转移、分化程度降低，TNM分期增加，RRBP1表达量相应增加，表明RRBP1表达变化与EC临床病理特征密切相关。可能原因为RRBP1可上调糖调节蛋白78表达，减低内质网应激反应，抑制EC细胞凋亡，促进其增殖、转运，进而促进EC病理特征恶性进展。廖代祥等[12]研究表明RRBP1在结直肠癌中表达水平升高，且与TNM分期、淋巴结转移、分化程度有关。本研究结果显示，RRBP1、EC临床病理特征的相关性研究与其相似，进一步分析发现RRBP1高表达量可增加EC发生风险，提示RRBP1在EC发生发展过程中发挥重要调控作用，其可能调节内质网应激反应，进而促进EC转移。RvD1可抑制白细胞介素6(IL-6)等炎性因子表达，进而抑制葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠直肠癌发生[13]。RvD1还可抑制磷酸化细胞外信号相关激酶(p-ERK)表达，进而抑制肝癌细胞增殖[14]。
本研究结果显示，EC组织、癌前病变组织中RvD1表达量低于癌旁组织，且EC组织低于癌前病变组，RvD1表达量降低与EC患者淋巴结转移、分化程度、TNM分期有关，RvD1低表达患者发生EC的危险度是高表达患者的1.751倍。由于EC发生发展与肿瘤微环境有关，炎性反应加剧可破坏肿瘤微环境稳定性，进而促进癌变的发生，RvD1可抑制炎性反应，调节多种信号通路表达，其在EC发生发展过程中可发挥抑癌基因作用。同时，本研究结果还显示，Nectin-4、RRBP1、RvD1联合诊断EC的AUC大于单项诊断，提示Nectin-4、RRBP1、RvD1对EC发生具有一定诊断价值。
综上所述，EC组织中Nectin-4、RRBP1表达量升高，RvD1表达量减低，可增加EC发生风险，且与淋巴结转移、分化程度、TNM分期密切相关，监测其表达量可能有助于判断EC患者病情严重程度，及时采取干预措施，可为临床EC的靶向治疗提供新方向。
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