赵梦瑶 潘芊钰 曹 颖
天津中医药大学中药学院，天津 301617
2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种代谢疾病，长期表现出高血糖的水平，受遗传因素和环境因素等多因素长期作用的影响，临床表现为血中的葡萄糖水平维持在较高的状态，多饮、多食、多尿、消瘦等。调查研究表明，目前我国糖尿病患病率较高，为11.2%[1]。因T2DM早期症状隐匿、并发症多，涉及神经、心脑血管等多个全身系统，且T2DM常引起并发症，如高血压、肾脏疾病等，严重危害国民健康。
中医药治疗T2DM旨在治疗“消渴”病症。随着中医对T2DM的观察研究，提出可以根据病程将T2DM分为四个时期：脾瘅；
（热中）消中、鬲消、肾燥；
消渴；
消瘅[2]。经过长期的治疗和探索，中医前辈们总结出了以下几种辩证论治：肺热伤津，润肺生津为主；
清热生津，益气养阴为主；
益气养阴，补益脾肾为主[3]。同时采用分时论治，单药治疗，针灸疗法等治疗手段。金芪降糖片是基于《备急千金要方》中的复方黄连丸结合现代临床研究开发的中成药，临床上用于治疗糖尿病安全且有效，有清热益气的功效，多用于治疗口渴多饮、气短乏力的气虚内热型消渴病[4]。临床上金芪降糖片对轻、中型非胰岛素依赖型糖尿病能达到良好的治疗效果，但其作用机制尚不完全明确[5]。
网络药理学结合生物信息学、药理学等多种学科，基于多种数据库能够初步揭示中药有效成分与疾病之间的关系[6]。本研究采用网络药理学的方法，初步研究金芪降糖片治疗T2DM相关靶点的作用机制，为临床研究提供理论支持。
1.1 金芪降糖片活性成分筛选及其作用靶点的预测
选择TCMSP数据库，以金芪降糖片中三味中药作为关键词进行检索，得到活性成分及作用靶点。筛选标准设置为口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）。将得到的有效成分进行相关靶点收集，得到的关键成分代入有机小分子生物活性数据库（PubChem）检索得到每个成分的分子结构式，通过小分子药物靶点预测在线平台数据库（Swiss Target Prediction）对每个成分进行靶点预测，使用蛋白质（Uniprot）数据库对靶点基因名进行规范。
1.2 T2DM靶点的获取
以“type 2 diabetes mellitus”为关键词，使用OMIM数据库、GeneCards数据库，检索T2DM的靶点，整合相关靶基因并删除重复靶点。
1.3 金芪降糖片治疗T2DM潜在作用靶点预测
通过Venny 2.1工具分析1.1和1.2项下得到的数据集并绘制韦恩图，得到药物-疾病共同靶点，即金芪降糖片作用于T2DM的预测靶点。
1.4 药物-成分-靶点网络构建
应用Cytoscape 3.7.2软件对金芪降糖片活性成分及治疗T2DM的预测靶点构建“药物-成分-靶点”网络图。
1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建
在STRING数据库中输入1.3项下得到的交集靶点，设置物种为“Homosapiens”，中等置信度（medium confidence）为0.4，构建PPI网络。利用Cystoscap 3.7.2软件对PPI网络拓扑分析，对PPI网络中的节点评价，分值大于平均分的基因即为金芪降糖片T2DM的核心靶点。
1.6 基因本体（gene ontology，GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析
使用基因富集分析工具David 6.8，筛选标准设置为P＜ 0.05，对上述得到的交集靶点导入分析工具，对其进行GO和KEGG富集分析，并将结果可视化处理，绘制气泡图。
2.1 金芪降糖片活性成分筛选和靶点预测
利用TCMSP数据库检索并进行条件筛选，得到金芪降糖片活性成分371个，黄连48个，黄芪87个，金银花236个。因每个成分可以作用于多个靶点，因此所得靶点存在重复值，合并数据库检索结果去重后，共得到活性成分54个，相关靶点697个。
2.2 T2DM潜在靶点预测
检 索OMIM数 据 库、GeneCards数 据 库、DrugBank数据库，汇总整理各数据库结果并剔除重复靶点，累计得到T2DM潜在靶点838个，利用Uniprot数据库修正全部靶点基因名。
2.3 金芪降糖片治疗T2DM潜在作用靶点
将上述得到的药物成分靶点与疾病靶点取交集，得到86个共同靶点，即为金芪降糖片治疗T2DM的潜在靶点，通过Venny 2.1绘制韦恩图（图1）。
图1 金芪降糖片与T2DM靶点韦恩图
2.4 药物-成分-靶点网络构建
在Cytoscape 3.7.2软件中导入2.1项下的54个活性成分与2.3项下的86个交集靶点，剔除与T2DM靶点无关成分的相关靶点，绘制“药物-成分-靶点”作用网络图（图2）。
图2 药物-成分-靶点作用网络图
2.5 PPI网络构建
将2.3项下的86个交集靶点上传至STRING数据库，下载TSV文本数据结果，再代入Cytoscape 3.7.2对结果进行可视化，构建PPI网络图（图3）。以度、介数中心性、平均最短路径长度、接近中心性4个参数为基础进行筛选，共86个节点、813条边，平均度值为18.9，节点平均介数中心性为0.595。以度值进行排序，得到37个靶点分值大于平均分，将排名前30的靶点使用R 3.6.1绘制条形图（图4）。
图3 金芪降糖片与T2DM关键靶点PPI网络图
图4 PPI拓扑分析的核心靶点排序（排名前30）
2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析
对86个共同靶点进行GO富集分析得到1855个GO条目（P≤0.05），结果显示，主要富集于生物学过程（biological process，BP），共1722条富集条目，包括肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰、肽激素反应、上皮细胞增殖、丝氨酸磷酸化等（表1）；
细胞组分（cellular component，CC）有32条富集条目，靶点参与最多的是主要作用于膜筏、膜微区；
分子功能（molecular function，MF）有101条富集条目，参与蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等过程。选取排名前10的GO条目绘制气泡图（图5）。
图5 金芪降糖片治疗T2DM的GO富集分析
表1 金芪降糖片治疗T2DM的GO生物过程分析
KEGG富集得到147条信号通路，将排名前20的通路可视化，绘制气泡图（图6），颜色越红表明显著性越高，关键通路有癌症中的蛋白多糖、前列腺癌、胰岛素抵抗HIF-1信号通路、脂质和动脉粥样硬化、内分泌抵抗等。
图6 金芪降糖片治疗T2DM的KEGG富集分析
金芪降糖片是治疗消渴症的经典名方，方中具有苦寒药性的黄连为君药，有清中焦湿热、泻火解毒的功效，以甘温药性的黄芪做为臣药来调和药性，黄芪善补肺气、益卫气，有提升运转之功，可调节脏腑功能，补脾健胃。金银花药性甘寒，长于清热解毒，在方中作为佐药，可以辅助黄连来增强清热泻火之效，诸药配伍精妙，共奏益气固本、标本兼治之功[7]。临床用于治疗以口渴多饮、气虚乏力为表征的T2DM，疗效较为理想[8]。大多数糖尿病患者的病因未知，但常伴有炎症过程，破坏免疫微环境稳态等。方中黄连中的小檗碱、木兰花碱；
黄芪中的黄芪甲苷；
金银花中的咖啡酸、绿原酸、木犀草苷等，可以起到抗炎、调节免疫细胞稳态的作用[9]。
本研究通过网络药理学方法筛选了金芪降糖片的54个有效成分，预测86个治疗T2DM的潜在靶点。根据PPI拓扑分析发现，蛋白激酶B1（AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等可能是金芪降糖片发挥作用的核心靶点。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其可以通过调节免疫相关途径，发挥抗炎、抗氧化应激，调节血脂、血糖水平等作用，从而可以用于辅助治疗T2DM[10]。MAPK1会在肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导剂在骨骼肌细胞激活，还参与了细胞的增殖、基因表达分化、存活和凋亡等多种免疫调节，免疫反应可以调节糖尿病患者的高血糖、氧化应激、生长因子等水平[9]。因此，推测金芪降糖片通过作用于核心靶点，参与多种生物过程发挥降糖作用。GO功能富集分析显示，在生物过程中肽基酪氨酸磷酸化和修饰起到重要作用，肽基酪氨酸是胰岛素受体和胰岛素受体底物中的重要成分。整个过程首先是肽基酪氨酸磷酸化，从而会使受体底物上的酪氨酸被残基化，其次磷酸化的P13K被激活后会作用于AKT，结果会导致细胞膜上的脂质双分子层磷酸化，血液中的葡萄糖转运到细胞内，通过负反馈调节来达到降低血糖的目的[11-12]。在细胞组分中，重点通路集中在膜筏、膜微区和膜区，并且细胞膜是这三种细胞组分主要存在的位置，细胞膜上富含多种离子通道与跨膜转运体，其中与T2DM有关的离子通道、跨膜转运体包括钙离子通道、ATP敏感型钾离子通道、葡萄糖转运体4、ATP结合转运体等[13]。由此推测金芪降糖片中的活性成分通过影响细胞膜上膜筏、膜区和膜微区上离子通道及跨膜转运体的活性，影响葡萄糖从血液到细胞中的转运，影响肝糖原、肌糖原的合成[14]。分子功能中通路是蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶作为Rho家族中GTP酶的重要效应物，能够参与多种细胞生物学过程，包括细胞转化、细胞形态学和动力学[13]。黄连素为黄连、黄芪中的主要成分，可以作用于蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶靶点，其主要目的是影响细胞膜上的GLUT4转运体，减轻胰岛素抵抗[9]。
综上，推测金芪降糖片通过多途径协同发挥降糖作用。KEGG通路结果表明，其最主要的通路是癌症中的蛋白多糖，可以抑制肿瘤细胞增殖和直接杀伤肿瘤细胞，参与相关细胞代谢、免疫反应等生理活动。癌症中的蛋白多糖能够改善细胞的糖脂代谢，抑制炎性因子释放，进而减轻胰岛素抵抗[15]。本研究基于网络药理学的方法，筛选得到金芪降糖片治疗T2DM的活性成分、靶点和通路，初步揭示金芪降糖片治疗T2DM的作用机制。结果表明，其发挥作用是通过多通路、多靶点共同参与，为临床应用的进一步研究提供理论依据。
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