牙春色 王紫瑗 李铭研 黄国东
肾病综合征是一组由多种原因引起的肾小球基底膜通透性增加，致使大量血浆白蛋白自尿中丢失而引起的临床综合征，具有尿蛋白大于3.5 g/d、血清白蛋白低于30 g/L、高脂血症、水肿四大特征，其中尿蛋白大于3.5 g/d、血清白蛋白低于30 g/L 为诊断所必需。肾病综合征患者常伴有脂质代谢紊乱，血浆总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白增高最为常见，其发生机制与肝脏合成脂蛋白增加、脂蛋白代谢能力下降、脂蛋白酶活性降低相关。根据病因不同可分为原发性肾病综合征和继发性肾病综合征。原发性肾病综合征是指排除继发性肾病综合征和遗传性疾病所致肾病综合征，且符合肾病综合征诊断标准。原发性肾病综合征主要病理类型有微小病变型肾病、系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、膜性肾病及局灶性节段性肾小球硬化。目前研究认为，炎症因子、肾脏固有细胞等均在其发生、发展、复发过程中发挥着不同程度的促进作用。
目前，原发性肾病综合征（PNS）治疗主要以糖皮质激素（如泼尼松、甲泼尼龙等）为主。糖皮质激素具有抗炎、抑制免疫、降低尿蛋白的作用。尽管糖皮质激素在原发性肾病综合征治疗方面承担着重要的角色，但长期使用会引发各种并发症，如感染、体抗力低下、骨质疏松等，且存在较多的不良反应限制了其在临床的应用。对于一种能积极控制病情且临床不良反应少的药物需求日益增大，中医药具有多靶点、临床疗效显著、安全性高的特点，可以增效减毒，减轻激素或者免疫抑制剂的不良反应，所以从中药中寻找治疗原发性肾病综合征的新药是具有前景的研究方向。
网络药理学具有整体性、系统性、动态性，与中医药的整体观、辨证论治原则不谋而合，为中医药的研究开辟了新的道路，近年来在许多方面都取得了明显的进展[1]。不同于化学药单一成分作用于单一靶点，中药作为天然药物，主要通过对复杂的疾病网络进行协同调节以交互式的网络调控方式来抑制整体的病理进展，构建疾病－基因－药物的多层次网络，能够揭示疾病、药物之间的内在联系和网络调节机制，虚拟筛选中药有效成分及其作用靶点，从而更全面深入地阐释中药的治疗机制[2]。
1.1 肾茶药物活性成分及其作用靶点的获取
通过数据库中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索猫须草的化学成分及对应的靶基因，以口服生物利用度（oralbioavailability,OB）≥30%和类药性（drug-like,DL）≥0.18 筛选中药的活性成分。利用Perl 软件在Uniprot 数据库中提取活性成分对应靶基因的缩写，删除检索结果中重复的靶点。
1.2 原发性肾病综合征疾病靶点的获取
以“primary nephrotic syndrome”作为关键词，在 genecards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）数据库中检索原发性肾病综合征疾病靶点。
1.3 构建韦恩图
应用R 软件3.6.1 将肾茶化学成分靶点和原发性肾病综合征疾病靶点进行映射构建韦恩图，交集的部分为肾茶活性成分靶点和原发性肾病综合征疾病靶点的共同靶点。
1.4 构建“活性成分-共同靶点”网络
根据肾茶的活性成分及预测的共同靶点，建立“活性成分-共同靶点”的相互对应关系，将相关的文本文档导入Cytoscape 3.6.1 软件中，构建“活性成分-作用靶点”网络图。
1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络
将共同靶蛋白复制到STRING 数据库在线平台（https://string-db.org/），蛋白种属设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为中等“medium confidence”（＞0.4），其他参数保持默认设置，构建PPI 网络图。应用R 语言3.6.1 软件对共同作用靶蛋白进行barplot 函数计算得到关键靶点。
1.6 基因本体（GO）富集分析和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
应用R 软件及Perl 软件对共同靶基因的ID 形式进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，保留P≤0.05 的结果，然后进行可视化处理，分析肾茶治疗原发性肾病综合征可能的生物过程和信号通路。
2.1 肾茶活性成分及靶点的筛选
在TCMSP 数据库中以OB≥30%和DL≥0.18 为筛选条件，共获得12 个肾茶活性成分。见表1。同时在TCMSP 数据库中对肾茶进行活性成分靶点预测，获得肾茶靶点，利用Perl 软件在Uniprot 数据库中提取活性成分对应靶基因的缩写形式，限定物种为“Homo Sapiens”，删除检索结果中重复的靶点，最终共获得40 个基因靶点。
表1 肾茶成分信息
2.2 疾病靶点的收集和筛选
在Genecards 数据库和OMIM 数据库检索与原发性肾病综合征疾病相关的基因，筛去重复基因，共得到2 024 个靶点。运用R 语言3.6.1 形成韦恩图，最终获得17 个肾茶药物和原发性肾病综合征疾病的共同靶点。见图1。
图1 肾茶成分靶点与原发性肾病综合征疾病靶点韦恩图
2.3 药物活性成分-共同靶点网络
肾茶的活性成分及共同靶点输入软件Cytoscape 3.6.1，构建“活性成分-共同靶点”网络，见图2。在“活性成分-作用靶点”网络图中，活性化合物节点度最高是beta-sitosterol（β-谷甾醇）、Stigmasterol（豆甾醇）。
图2 肾茶活性成分和交集靶点网络关系的构建
2.4 共同靶点PPI 网络构建
在STRING 数据平台输入17 个共同靶点，得到PPI 网络图（图3）。应用R 语言3.6.1 软件对肾茶成分-疾病的17 个共同作用靶蛋白进行barplot 函数计算得到柱状图，见图4，其中频数最高的为环氧合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS2）、JUN、半胱氨酸肽酶3（caspase3,CASP3）等基因，可能为肾茶治疗PNS 的核心靶点基因。
图3 共同靶点PPI 网络
图4 共同靶点频数
2.5 关键靶点GO 富集分析
应用R 软件及Perl 软件对共同靶基因的ID 形式进行GO 富集分析，根据保留P≤0.05 的结果，进行可视化分析，得到GO 富集分析气泡图，主要涉及肽链内切酶活性、半胱氨酸性内肽酶活性参与凋亡过程、半胱氨酸型链内切酶活性、半胱氨酸型肽酶活性、死亡受体结合、儿茶酚胺结合、肿瘤坏死因子受体超家族、过氧化物酶活性、类固醇激素受体活性、氧化还原酶活性、G 蛋白偶联胺受体活性、抗氧化活性、双加氧酶活性等生物过程。见图5。
图5 交集靶点GO 富集分析气泡图
2.6 KEGG 通路富集分析
应用R 软件及Perl 软件对共同靶基因的ID 形式进行KEGG 通路富集分析，根据保留P≤0.05 的结果，进行可视化分析，得到共同靶基因KEGG 通路富集分析气泡图。见图6。共同靶点主要富集于脂质-动脉粥样硬化信号通路、神经退行性变-多重疾病信号通路等信号通路上。
图6 共同靶点KEGG 分析气泡图
肾茶为唇形科肾茶属多年生草本植物，因其雄蕊酷似猫须，又名“猫须草”“猫须公”，傣名“雅糯妙”，为知名度较高的民族药，在我国主要分布在云南、广西、广东、海南、福建等地区。壮医认为肾茶性凉，味甜、淡，具有清热解毒、通水道之功，可治疗笨浮等病证，是壮医临床常用品种[3]。肾茶在泌尿系统疾病方面起到治疗和保健作用，其临床疗效显著，在傣族、佤族、拉祜族等民族地区应用历史悠久，现已在云南被开发成泡袋茶，是傣族传统的药食两用植物[4]。现代药理学研究表明，肾茶具有利尿、抗氧化、抗炎、降脂等药理作用[5]。蓝伦礼等[6]发现猫须草醇提物在体内能升高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性，增强抗氧化能力，减轻肾氧化性损伤。肾茶多种化合物具有抑制NO 生成活性，参与NF-κB 等信号通路，抑制TNF-α、IL-6 等炎症因子的表达，达到抗炎的作用[7]。动物模型证实肾茶可通过减少尿蛋白的释放，降低BUN、Scr、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平，下调SOD 活性等保护机体肾功能[8]。肾茶通过抑制NF-κB 活性可降低肾病大鼠的尿蛋白[9]。大量蛋白尿是原发性肾病综合征的主要病理特点，目前研究认为，脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症反应等这些病理因素相互作用，互相招募激活，形成恶性循环导致肾小球滤过膜通透性增高、肾小球基底膜增厚、足突融合是形成大量蛋白尿的主要原因，目前研究证实肾茶具有降尿蛋白、降脂、抗氧化、抗炎、保护肾功能的作用，但目前肾茶治疗原发性肾病综合征的具体作用机制却少有报道。本研究通过网络药理学方法，筛选出肾茶药物有效活性成分，构建肾茶与原发性肾病综合征共有靶点，预测肾茶作用于原发性肾病综合征的靶标和通路，探讨该药治疗原发性肾病综合征的有效成分及作用机制，目的探究中医药治疗原发性肾病综合征的具体机制。
本研究共筛选出肾茶12 个潜在的有效成分，有对应靶点的化合物9 个，与原发性肾病综合征疾病靶点映射后得到17 个预测的共同靶点，明确肾茶主要化合物为beta-sitosterol、Stigmasterol、Truflex OBP、
vittadinoside_qt、Mandenol、7-O-Methyleriodictyol、CLR 等，其中“肾茶活性成分-共同作用靶点”网络中，节点度最高的是 beta-sitosterol β-谷甾醇、Stigmasterol 豆甾醇。β-谷甾醇、豆甾醇是含量最丰富的植物甾醇，广泛存在于植物体内，参与植物细胞内各种生命活动，具有降脂、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化的作用[10-11]。研究发现β-谷甾醇通过下调NPC1L1、ACAT2 和MTP mRNA 水平抑制胆固醇的吸收[12]，通过激活环磷酸腺苷蛋白激酶来活化脂肪，达到抗氧化、抗衰老的目的[13]。豆甾醇可通过减少ROS 生成，增强SOD 和CAT 活性，降低BAX丰度，升高p53 蛋白水平等有效抑制血管细胞增殖，为预防动脉粥样硬化和再狭窄的治疗提供参考[14]。有研究表明，β-谷甾醇和豆甾醇也能显著抑制炎症因子NF- kB 信号通路的激活[15]，可显著抑制与炎症相关的细胞因子TNF-α、MCP-1、IL-6 等的表达，对COX-2 的表达具有明显的抑制作用[16]。肾茶有效活性成分具有降脂、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化的作用，体现了中药治疗疾病多成分、多靶点的特点。
结合共同靶点频数图，肾茶治疗原发性肾病综合征的核心靶点主要包括PTGS2、JUN、CASP3 等基因。其中，PTGS2 又称COX-2，通过增加促炎因子表达，破坏LDLr 负反馈调节通路，上调足细胞LDLr 表达，增加足细胞内胆固醇摄入，致使足细胞脂质过度沉积而引起细胞损伤[17]。此外，COX-2 为肾血流动力学及炎症反应的关键调节因子，在足细胞损伤时异常激活[18]。JUN 基因包含JNK，JNK 信号通路参与细胞增殖、凋亡和应激等多种生理和病理过程，可通过参与细胞凋亡、组织慢性炎症反应等作用间接诱导肾纤维化，促进肾脏纤维化进展[19]，活化后可加速肾足细胞损伤和凋亡，破坏肾小球滤过屏障的完整性[20]。CASP3 是细胞凋亡信号通路中的关键调节位点，它的激活可进一步激活下游信号调节因子促进细胞凋亡[21]，是肾脏氧化应激引起足细胞凋亡损伤的重要细胞因子[22]。上述靶蛋白通过脂质摄入沉积、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等方面作用于在肾小球内皮细胞，笔者认为其可能成为肾茶治疗PNS 的关键靶点。
GO、KEGG 分析结果提示，肾茶可能通过脂质-动脉粥样硬化信号通路、神经退行性-多重疾病信号通路、IL-17 信号通路、NF-κB 信号通路等，完成肽链内切酶活性、半胱氨酸性内肽酶活性参与凋亡过程、半胱氨酸型链内切酶活性、半胱氨酸型肽酶活性、死亡受体结合、肿瘤坏死因子受体超家族、过氧化物酶活性、类固醇激素受体活性、氧化还原酶活性、抗氧化活性等生物过程，调控PTGS2、JUN、CASP3 等靶点治疗原发性肾病综合征。KEGG 通路富集分析发现，脂质-动脉粥样硬化信号通路为肾茶治疗原发性肾病综合征的最主要通路。1982年，Moorhead 等提出“脂质肾毒性”假说，认为脂质异常可导致动脉粥样硬化和肾小球硬化，脂质导致的组织损伤涉及脂质摄取、氧化应激和炎症反应等几个关键环节。研究表明，高脂血症可以使氧化低密度脂蛋白（oxLDL）在肾脏沉积、炎症细胞浸润、肾脏固有细胞增殖和损伤、细胞外基质积聚和泡沫细胞形成，直接间接地导致肾小球硬化，可以同时对肾脏系膜细胞、内皮细胞和足细胞造成损伤，在诸多损伤中足细胞可能是最主要的受害者[23]。LDL 和oxLDL 可促进肾脏免疫细胞活化，继而上调NF-κB活性[24]，活化的NF-κB 可增强TNF-α、IL-6 等炎症因子和MCP-1 的表达，几者多水平上相互作用，互相招募激活，形成恶性循环，通过直接结合暴露于足细胞的相关受体而造成足细胞损伤[25]。TNF-α 可通过旁分泌与自分泌的方式，与足细胞表面TNFR1型受体结合，引起足细胞表面血管紧张素受体1 型受体表达增加，足细胞骨架蛋白Nephrin 分子表达减少，导致足细胞凋亡和损伤的发生[26]。巨噬细胞分泌的TNF-α 可通过激活p38 MAPK 和JNK 信号通路抑制足细胞特有蛋白Nephrin 和Podocin 的活性，诱导足细胞损伤，增加尿蛋白的排泄，加重肾脏损害[27]。MCP-1 通过CCR2-Rho 激酶依赖性激活受体CCR2，下调Nephrin 的表达，对足细胞有直接损害作用[28]。IL-6 是一种典型的炎症细胞因子，释放增加可诱发内质网应激（ESR）[29]，当ESR 下游IRE1α通路激活时，高表达的IRE1α 能够通过促进JNK 的磷酸化来增加CASP3 的表达并介导足细胞发生凋亡，Nephrin、Podocin 复合物减少，进而逐步出现肾小球滤过功能下降[30-31]。血脂水平过高会导致机体内产生大量ROS[32]，ROS 是正常足细胞的代谢产物，当ROS 产生过多或清除减少，机体氧化还原水平失衡，促氧化酶系统过度激活和抗氧化酶系统（例如SOD）活性降低，导致足细胞发生氧化应激损伤[33]。研究表明，激活SOD 等抗氧化因子可以显著增加肾脏组织中Nephrin、Podocin 表达，改善足细胞损伤[34]。脂质-动脉粥样硬化信号通路涉及脂质摄入沉积、炎症反应、氧化应激等途径减少足细胞表面裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin 表达，直接、间接损伤足细胞。综上所述，本研究通过网络药理学探讨了肾茶治疗原发性肾病综合征的可能作用机制，肾茶中豆甾醇、β-谷甾醇等有效化合物可能通过脂质-动脉粥样硬化信号通路，作用于PTGS2、JUN、CASP3 等靶点，进而发挥对原发性肾病综合征足细胞保护作用，为该药治疗原发性肾病综合征机制的研究提供了思路。此外，本研究挖掘出Nephrin、Podocin、NF-κB、TNF-α、IL-6、MCP-1、ROS、SOD 等其他靶点基因，可为肾茶治疗原发性肾病综合征的临床及动物实验验证研究提供基础依据。
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