冯梦迪，马雪连，孙亚伟，易鹏飞，吴 静，王 凡，陈玉珠，杨朝辉，钟 旗，姚 刚
(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；
2.新疆畜牧科学院研究所，新疆乌鲁木齐 830011)
母牛的妊娠损失是指胎儿或胚胎与母体之间由于疾病、中毒、应激、营养和饲养管理不当等多种因素的影响下发生的胎儿或胚胎病理变化，造成妊娠中断，最终胎儿死亡的现象，主要表现为流产和死胎[1]。导致妊娠损失的主要疫病有牛传染性鼻气管炎(Bovine infectious rhinotracheitis，IBR)、牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)和布鲁氏菌病(Brucellosis)等。世界动物卫生组织曾将IBR列为B类疫病[2]，我国明确规定，凡是进出口的牛及其相关制品，必须进行IBRV的检测。BVD是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一种急性、热性传染病[3]；
20世纪80年代初首次证实BVDV在我国存在[4]，新疆部分地区牛群BVDV抗体平均阳性率在70%左右[5]。布鲁氏菌病是危害公共卫生和家畜养殖业的人兽共患病之一，以牛和羊的感染最为严重[6]。布鲁氏菌可引起怀孕母畜发生流产，常见于妊娠的中后期，且流产后长期不孕[7]。本研究针对2020年-2021年新疆某安格斯肉牛场母牛妊娠损失进行调查，对妊娠损失相关疫病IBR、BVD和布鲁氏菌病进行病原检测，筛查导致母牛妊娠损失的主要原因，以期为防控牛场母牛妊娠损失提供科学依据。
1.1 材料
1.1.1 样品 针对新疆某安格斯肉牛繁育场2020年-2021年母牛妊娠损失情况进行临床调查，并采集新疆某规模化肉牛繁育场有妊娠损失史的母牛鼻拭子、肛拭子、抗凝血以及全血样品各150份，全血分离血清，抗凝血4℃保存，其他样品置-20℃保存，用于实验室进行后续检测。
1.1.2 试剂 天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，2×TaqPCR Mix，北京天根生化科技有限公司产品；
DNA Marker DL 2 000，北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品；
Omega组织DNA提取试剂盒，Omega Bio-Tek公司产品；
Trizol，Invitrogen公司产品；
反转录试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品；
1×TAE缓冲液，扬州优邦生物科技有限公司产品。
1.1.3 主要仪器设备 PCR扩增仪，德国Eppendorf公司产品；
电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；
凝胶成像仪(Universal Hood Ⅱ)，Bio-Rad公司产品；
离心机，上海凌仪生物科技有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 IBRV的检测
1.2.1.1 IBRV PCR检测 根据Omega组织DNA提取试剂盒操作说明书对采集的150份鼻拭子提取DNA。参照GenBank已公布的IBRV序列利用Primer 5.0设计引物，IBRV-F：5′-CTCTACCGCACGGGCACCT-3′，IBRV-R：5′-GCGGCTCTCGTCTCGCA-3′；
扩增片段长度为360 bp。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
反应体系为：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用ddH2O补至25 μL。PCR扩增条件为：95℃ 5 min；
95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环；
72℃再延伸10 min。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.1.2 IBRV-Ab ELISA检测 采用牛传染性鼻气管炎病毒抗体(IBRV-Ab)ELISA检测试剂盒，按照操作说明，根据显色的深浅，并用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，判断样品是否含有IBRV-Ab。根据样品的OD值判断结果。试验有效性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；
阴性对照孔OD值平均值≤0.15。临界值=阴性对照孔平均值+0.15；
样品OD值<临界值，样品为阴性；
样品OD值>临界值，样品为阳性。
1.2.2 BVDV RT-PCR检测 用Trizol法提取150份肛拭子样品的RNA，参照GenBank已公布的BVDV序列用Primer 5.0设计的引物，BVDV-F：5′-AGTCGTCAGTGGTTCGAC-3′，BVDV-R：5′-TCCATGTGCCATGTACA-3′；
扩增片段长度为201 bp。RT-PCR检测方法检测BVDV，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系为：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，用ddH2O补至25 μL。PCR反应条件为：95℃ 5 min；
95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环；
72℃再延伸10 min。PCR产物经20 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.3 布鲁氏菌的检测 对150份血清样品进行布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)，按照文献[8]进行结果判定，阳性血清再用特异性高的半抗原-琼脂扩散试验(NH-GD)进行最终确诊。
1.3 数据处理与统计分析
用Excel MATLAB Origin数据处理软件对检测结果进行统计，用分布式计算集群分析和分类汇总数据。
2.1 妊娠损失临床调查结果
该牛场分别在2020年3月和6月进行全群布鲁氏菌病免疫；
在2021年2月～4月全群免疫BVDV，5月底免疫效价检测结果显示，该牛场BVDV抗体阳性率87.5%；
2021年7月～9月对部分牛进行了IBRV免疫。本研究于2020年10月18日至2021年10月9日，调查新疆某安格斯肉牛繁育场的妊娠母牛定胎头数9 860头。累计妊娠损失422头次，妊娠损失率为4.28%。其中流产214头次，流产占妊娠损失的50.71%；
死胎208头次，死胎占妊娠损失的49.29%。流产平均在胎天数175 d，死胎平均在胎253 d(表1)。
表1 母牛妊娠损失的季节变化
2.2 妊娠损失相关疫病检测结果
2.2.1 IBRV检测结果 检测样本数为150头份，ELISA阳性95头份，阳性检出率为63.33%；
PCR阳性64头份，阳性检出率为42.67%。部分妊娠损失母牛鼻拭子阳性样本PCR检测结果见图1。在360 bp处出现IBRV特异条带。IBRV抗体阳性率为63.33%(95/150)，抗原阳性率为42.67%(64/150)。对相应样本的IBRV抗原与抗体检测结果进行比较表明，发现抗原呈阴性、抗体呈阳性较多，占检测样本总数的39.33%(59/150)，结果见表2。
表2 IBR抗原抗体检测结果比较
M.DNA标准DL 2 000；
NC.阴性对照；
AC.阳性对照；
1～15.样品PCR检测结果
2.2.2 BVDV检测结果 用PCR技术对150份粪便样品进行病原检测，共检出2份阳性BVDV，阳性率为1.33%，部分PCR电泳结果见图2。
2.2.3 布鲁氏菌检测结果 对150份血清样品检测结果显示，RBT检测阳性率为10.67%，SAT检测阳性率为0，对经RBT检测阳性的16份样品再进行NH-GD检测，阳性率为0(表3)。
表3 布鲁氏菌病检测结果
引起母牛妊娠损失的因素很多，一般分为传染性因素和非传染性因素。传染性因素[9]包括细菌、病毒、真菌、原虫等，非传染性因素有营养、遗传、应激等因素[10]。对该牛场从饲料质量角度分析，2021年8月部分圈舍出现大面积腹泻，通过检测饲草，查看现场，判断与饲喂草料配比不规范有关。及时调整饲料配比，8月底至10月流产2头，与期间共计36头流产头数相比，整改措施显著。新疆地区冬夏温差较大，饲料保存不当可造成霉变或营养流失，妊娠母牛中毒或营养缺乏发生妊娠损失。该牛场发生妊娠损失的母牛均为头胎牛，易发生妊娠损失。秋季发生妊娠损失的母牛为5.35%，比春季高1.81%，比夏季高1.13%，比冬季高1.07%。该牛场在2月～4月BVDV疫苗注射后60 d内流产早产比例达12%，说明BVDV疫苗注射与妊娠损失有一定的关系。对免疫效价检测显示有其他环境菌感染的可能性。
BVDV和IBRV均可通过宫内感染引起妊娠母牛流产、死产、不孕等症状，是导致母牛发生妊娠损失的重要病毒病原体[11]。本调研结果发现引起新疆某肉牛场母牛流产的病原主要是IBRV和布鲁氏菌。IBRV抗体阳性率为63.33%(95/150)，该肉牛场应重视IBRV防控，加强对IBRV的免疫。该牛场进行了BVDV全群免疫，是否为一过性感染有待确定，所以对于BVD的防控不能松懈。对采集样品进行布鲁氏菌病检测，RBT阳性率为10.67%，SAT和NH-GD无阳性结果，说明该肉牛场2020年-2021年度布鲁氏菌病防控工作良好。
本调查发现该肉牛养殖场存在BVDV和IBRV感染，这两种病原体在母牛的妊娠损失中存在协同作用的可能[12]。建议用IBR灭活苗或BVD-IBR二联灭活苗免疫健康牛，剔除BVDV的持续性感染牛；
同时加强布鲁氏菌病抗体监测，对布鲁氏菌抗体阳性牛定期复检，如再有阳性出现，淘汰阳性牛。制定并实施牛场的疫苗免疫和生物安全风险防控措施，以期降低母牛妊娠损失。