包秋华，刘倩宇
（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业农村部奶制品加工重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）
活的非可培养状态（viable but non-culturable，VBNC）是指细菌处于不良环境胁迫条件下进入的一种特殊状态，其在常规培养基上不能培养，但实际上采用非可培养方法检测是活的，仍具有低的代谢活性，当条件合适时又可以恢复生长繁殖能力复苏到可培养态，被认为是细菌躲避不良环境的一种生存策略[1-5]。VBNC的概念首次由Xu Huaishu等[6]于1982年提出，描述了在河流和海洋环境中埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）存在VBNC。由于细菌VBNC的存在严重影响着基于细菌可培养性的传统检测方法的准确性[1]。随后在国内外引起了极大反响和关注。VBNC细菌的发现对传统的微生物学、食品安全、传染病学等研究均提出了新的挑战[2]。
迄今为止，已有超过100 种微生物被证实可进入VBNC，包括细菌和真菌，细菌又分致病菌和非致病菌[1]。其中致病菌有埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）[1,6-8]、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）[1,6,9]、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[10]、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）[11]、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）[12]、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）[13]、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）[14]、沙门氏菌（Salmonella）[15]、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）[16]、丁香假单孢杆菌（Pseudomonas syringae）[17]和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[18]；
非致病菌有食品中常见的双歧杆菌（Bifidobacterium）[19]、乳酸杆菌[20]、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）[21]和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）ND02[22]等。由于可培养细胞与VBNC细胞在生理特性（耐化学性、黏附性、细胞形态、代谢、基因表达、膜和细胞壁组成、毒力）等方面有很大差异，所以不同细菌在不同条件下VBNC的诱导、复苏、特性分析、检测方法、机理探究等多方面被广泛研究[1,6-27]。另外，自然界中99%以上的微生物因各种环境压力的驱使而处于VBNC无法分离培养，导致它们不能被充分的研究和利用[28]。
近30 年来，细菌VBNC的研究文献数量逐年增加，并取得了突破性的研究成果，为食品安全、微生物的开发利用等提供了重要指导，但目前缺少关于细菌VBNC文献的综述。为了全面了解国内外细菌VBNC的研究现状和发展趋势，本文利用Web of Science进行文献检索，利用文献计量学方法分析VBNC研究领域的研究热点及发展状况等。
1.1 数据来源和提取
本研究数据来源于科睿唯安Web of Science-Science Citation Index（SCI）中的所有数据库。首先以“主题词＝VBNC”进行检索，即标题、摘要、作者和关键词中有“VBNC”的文献均被搜集。SCI收录文献中出现VBNC相关报道的最早时间为1994年，故选择时间跨度为1994—2021年（数据检索截止时间为2021年12月31日），共检索出以细菌VBNC为主题词的研究类文献911篇；
然后选取Web of Science核心合集数据库（是所有数据库中的一种），选取Article和Review两种文献类型，点击“精炼”，显示以VBNC为主题词的文献有836 篇。本文以836 篇VBNC文献作为研究对象，利用Web of Science平台分析检索结果功能，得到VBNC研究发表论文在出版年、国家或地区、机构、来源出版物、研究方向等方面的详细数据。
1.2 研究方法
文献计量法是基于统计学和数学的定量分析方法，该方法以相关文献为研究对象，根据各类文献信息对某个研究领域的现状及其发展趋势进行客观描述[29]。本文利用Web of Science平台、Excel软件和Cite Space 5.8软件的分析功能以及人工筛选方法等，对发表论文量、发表时间、发文机构、来源出版物、研究方向、关键词、研究热点等多维度进行统计及分析，以期揭示细菌VBNC状态的研究现状及发展趋势。
在Web of Science平台中的所有数据库SCI数据源显示1994—2021年间有关VBNC研究文献共911 篇，包括了12 种文献类型，从中精炼出836 篇文献（包括Articles和Review 2 种类型）作为研究对象，占文献总数的91.77%。选取两个时间区段进行对比分析，分别为1994—2010年和2011—2021年。分析内容包括发表论文量、发表时间、发文机构、来源出版物、研究方向、研究热点等。
2.1 年度统计文献数量
1994—2021年期间，细菌VBNC研究的出版年发表论文量见图1，可以看出，文献数量除个别年份有所波动外，总体上呈现相对稳定的增长趋势。
图1 1994—2021年细菌VBNC研究的出版年发表论文量趋势Fig.1 Annual number of research papers on bacteria VBNC state published from 1994 to 2021
在文献计量学领域，文献发表数量的变化直接反映了某学科的发展动态与趋势[30]。细菌VBNC研究最早发文是1994年发表的1 篇文献。该文指出痢疾志贺氏菌I型的VBNC不但具有不可培养特性外，还具有能主动吸收蛋氨酸，又能将蛋氨酸合成蛋白质的能力，说明其具有潜在致病性[31]。从图1可以看出，自1994年以来，文献发表量持续上升，2010年达到小的高峰，2011年文献发表量出现了下降趋势，但是从2011年后又呈现稳定增长状态。所以本文后续数据分析将时间区段分为1994—2010年和2011—2021年。1994—2010年的VBNC研究的发文量为253 篇；
2011—2021年发文量为583 篇，占文献总量的69.74%，是过去17 年（1994—2010年）发文量的2.30 倍。Web of Science是获取全球学术信息的重要数据库平台，Web of Science三大引文索引（科学引文索引（SCIE）+社会科学引文索引（SSCI）+艺术人文引文索引（A&HCI））收录了全球18 250多种权威的、高影响力的国际学术期刊，内容涵盖自然科学、社会科学、艺术与人文等学科领域，其中SCIE涵盖1900年至今的178 个学科的9 300多种主流期刊。Web of Science拥有严格的筛选机制，其依据文献计量学中的布拉德福定律，只收录各学科领域中的重要学术期刊[32]。在Web of Science平台的所有数据库中，虽然输入查询起止时间为1982—2021年，但没有查到1994年之前以VBNC为主题词的文献，可能有3 种原因：1）1982—1993年的VBNC论文期刊不被Web of Science收录；
2）主题词VBNC发生演变；
3）内蒙古农业大学未购买此库中1994年之前的回溯文献。经求助科睿唯安总部的Web of Science平台进行VBNC搜索，数据结果变化不大，说明以前二个原因为主，所以本文所用数据能满足分析细菌VBNC研究进展的需求。
分析1994—2021年期间VBNC文献的国家来源，结果发现836 篇细菌VBNC研究文献来自67 个国家或地区，2 个不同时间区段细菌VBNC研究发表论文量前10 名的国家或地区分布情况见表1。1994—2010年（225 篇）和2011—2021年（511 篇）2 个时间区段发表论文量排名在前10 位的国家或地区共参与736 篇文献的发表，占文献总量的88.04%，发表论文量非常集中。
表1 1994—2010年和2011—2021年细菌VBNC研究发表论文量前10 名的国家或地区分布情况Table 1 Distribution of the top 10 countries or regions for the number of research papers on bacterial VBNC state published from 1994 to 2010 and from 2011 to 2021
从表1可看出，1994—2010年期间，美国有关细菌VBNC研究发表论文量居全球第一，法国紧随其后；
2011—2021年期间，中国有关细菌VBNC研究发表论文量占比为27.27%，远超美国，跃居世界第一。这说明目前中国在世界细菌VBNC研究领域占有非常重要的地位。
2.2 发文机构分析
2.2.1 总体分析
1994—2021年期间，836 篇细菌VBNC研究文献有1 528 个机构参与，细菌VBNC研究发表论文量前10 位的机构分布情况见表2。发表论文量排名在前10 位的机构共参与250 篇文献的发表，占文献总量的29.90%，文献量不集中。
表2 1994—2021年细菌VBNC研究发表论文量前10 名的机构分布情况Table 2 Distribution of the top 10 institutions for the number of research papers on bacterial VBNC state published from 1994 to 2021
从表2可以看出，1994—2021年间发表论文量排名前10 位的机构分别是美国北卡罗来纳大学、美国马里兰系统大学、法国国家农业食品与环境研究院、法国国家科学研究中心以及中国的浙江大学、华南理工大学、中国科学院、浙江师范大学、中国农业大学、中国科学院城市环境研究所。这10 个机构中有2 个机构来自美国，2 个机构来自法国，6 个机构来自中国。前10 名的发文机构中美国的发文机构均为高校，法国的发文机构均为研究机构，中国的发文机构为高校和研究机构，这说明美国、法国、中国在细菌VBNC研究领域拥有稳定、持续的研究团队，研究规模大。
论文的被引频次是文献计量学中反映论文质量和影响力的一个重要指标[33]。从表2可以看出，北卡罗来纳大学的总被引频次（4 511 次）和篇均被引频次（137 次）均为最高，说明该校细菌VBNC研究起步较早，受关注程度较高，细菌VBNC领域研究成果较多且影响力较大，被认可程度较高。
h指数是美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校的物理学家乔治·赫希（Jorge Hirsch） 提出的一个混合量化指标，可用于评估研究人员的学术产出数量与学术产出水平。一个人的h指数是指在一定期间内他发表的论文至少有h篇的被引频次不低于h次。比如，一个学者总共发表的论文数为Np，其中有h篇论文的被引次数都大于或者等于h，其他的（Np-h）篇论文被引次数都小于h，则该学者的科研水平指数就为h[34-35]。篇均被引次数与h指数均为质量兼顾性指标，篇均被引次数兼顾了论文整体的数量与质量，而h指数均衡兼顾了h篇被引论文的质量与数量，h指数能够校正篇均被引次数对论文数量少、高被引综述类论文数量较多因素引起的过高评价[30,33-36]。从表2可以看出，h指数前3 位的发文机构分别是北卡罗来纳大学、马里兰系统大学、法国国家农业食品与环境研究院，说明这3 所机构在国内外细菌VBNC研究领域发表的论文数量较多且质量高，有较强的学术影响力。
2.2.2 分时间段分析
将按两个不同时间段细菌VBNC研究发表论文量对比，前5 名的发文机构对比情况见表3，可以看出，1994—2010年期间发文机构集中在北卡罗来纳大学、维罗纳大学、法国国家农业食品与环境研究院、马里兰系统大学、法国国家科学研究中心。2011—2021年发文机构集中在华南理工大学、浙江大学、中国科学院、马里兰系统大学、浙江师范大学，其中有4 所机构是中国的。表明两个不同时间段发表论文量居前5的机构发生明显变化。
表3 1994—2010年和2011—2021年细菌VBNC研究发表论文量前5 名的机构对比情况Table 3 Comparison of the top five institutions that produced research papers on bacterial VBNC state from 1994 to 2010 and from 2011 to 2021
2.3 来源出版物分析
对所刊载论文的来源出版物进行统计分析，可以确定某一研究领域期刊发表的核心阵地，有助于了解该领域的主要研究成果，也能指导科研人员选择重点出版物进行阅读和投稿。根据文献的集中分散规律，某一研究领域的大多数文献相对集中在少量期刊上，而剩余的文献则分布在其他大多数的相关期刊上[34]。
2.3.1 总体分析
将1994—2021年期间的836 篇文献根据来源出版物进行检索分析，结果显示这些文献来自355 个出版物，平均每种出版物载文2.35 篇。细菌VBNC研究发表论文量前10 名的出版物分布情况见表4，发表论文量前10 名的出版物（Applied and Environmental Microbiology、Frontiers in Microbiology、International Journal of Food Microbiology、Journal of Applied Microbiology、Food Control、Journal of Microbiological Methods、Water Research、Letters in Applied Microbiology、Food Microbiology和PLoS ONE）累计发文262 篇，占比31.34%。按照布拉德福划分核心期刊的三区分法（核心区、相关区、离散区）[35,37]。前10 种期刊处于细菌VBNC研究的布拉德福核心区，因此这些期刊是查阅细菌VBNC文献资料的重要信息源。发表论文量前10 名出版物的出版地集中在英国（占比50%）、荷兰（占比20%）、美国（占比20%）和瑞士（占比10%）4 个国家。根据2021年期刊引用报告（Journal Citation Reports，JCR）分区，发表论文量前10 名的出版物JCR分区相对靠前，Q1有6 个，Q2有2 个，Q3有2 个。根据2021年影响因子数据，发表论文量前10 名出版物的影响因子范围在2.363～11.236。
表4 1994—2021年细菌VBNC研究发表论文量前10 名的出版物分布情况Table 4 Distribution of the top 10 journals for the number of research papers on bacterial VBNC state published from 1994 to 2021
2.3.2 分时间段分析
将1994—2021年期间的836 篇文献根据来源出版物按着两个不同时间段进行对比分析，结果显示1994—2010年来源出版物有128 个；
2011—2021年来源出版物有291 个。两个时间区段细菌VBNC研究发表论文量前5 名的出版物对比情况见表5。1994—2010年发表论文量前5 名的出版物有Applied and Environmental Microbiology、Journal of Applied Microbiology、Letters in Applied Microbiology、FEMS Microbiology Ecology和Environmental Microbiology。2011—2021年发表论文量前5 名的出版物有Frontiers in Microbiology、International Journal of Food Microbiology、Food Control、Applied and Environmental Microbiology和PLoS ONE。两个时间区段细菌VBNC研究发表论文量前5 名的出版物有明显的差异，表明细菌VBNC投稿期刊范围更加广泛。
表5 1994—2010年和2011—2021年细菌VBNC研究发表论文量前5 名的出版物对比情况Table 5 Comparison of the top five publications that published research papers on bacteria VBNC state from 1994 to 2010 and from 2011 to 2021
2.4 研究方向分析
将Web of Science核心合集中1994—2021年期间的836 篇文献按研究方向分类，细菌VBNC研究方向分布于在96 个研究领域。不同时间区段细菌VBNC研究发表论文量前10 名的研究方向对比情况见表6。近11 年来细菌VBNC研究方向变化不大，微生物学领域发表论文量始终排名第一，始终是细菌VBNC领域最主要的研究方向。传染病学、生物化学分子生物学和微生物学始终处于前3 名，科学技术其他专题研究领域发表论文量增加较多，排名上升明显。生物化学分子生物学、环境科学生态学、生物技术应用微生物学领域发表论文增量小，排名退步。细菌是生物范畴内的微生物，有关微生物等方面的研究与其发展十分同步。关于细菌VBNC病毒学、热带医学、海洋学、医疗检验技术、普通内科方面的研究文章占比很少，究其原因，是因为该领域研究难度较大，技术不成熟。
表6 1994—2010年和2011—2021年细菌VBNC研究发表论文量前10 名的研究方向对比情况Table 6 Comparison of the top 10 research directions in bacteria VBNC state published from 1994 to 2010 and from 2011 to 2021
2.5 研究热点分析
研究热点是指在某一时间段内，有内在联系的数量相对较多的一组论文所探讨的研究问题和专题[28]。通过研究热点的分析，可以有效地把握当前研究领域的研究动向。目前常用于绘制知识图谱的软件有Cite Space和VOS viewer等，其中Cite Space在实际应用中使用较为广泛。Cite Space是可视化文献分析软件，功能选项主要包括共现分析、合作分析、共引分析和耦合分析。可以通过关键词共现图谱得到研究热点[29,38-40]。
为了分析近些年细菌VBNC状态研究热点，将近11 年（2011—2021年）关键词数据导出，运用Cite Space软件绘制共现知识图谱和突现知识图谱。具体操作流程：将Web of Science中导出的关键词数据导入Cite Space 5.8软件，设置time slicing（时间分段）11 年，结点选择keywords，点击go，再点击可视化，得出关键词共现图（图2），并得到频次、中介中心性数据，整理制得表7、8。在共现图可视化菜单下有burstness（突现），点击进入，再点击refresh、view，弹出对话框点击确定，得到关键词突现图，分析所得数据最终得出研究热点。
下面对2011—2021年的各个结果逐一展示和分析。
2.5.1 关键词共现图和高频关键词分析
由Cite Space 5.8软件得到的2011—2021年细菌VBNC研究领域关键词共现图（图2）。图2中圆圈代表关键词出现的频次，某个关键词出现的次数越多，其圆圈越大，表明它是细菌VBNC领域的研究热点。关键词之间的连接线表明两个关键词在同一篇文章中出现，连线越粗标识两者共现的频次越高[30]。图2中共有80 个节点，表示有80 个关键词，关键词之间的连线数量是91 条，网络密度是0.028 8。
图2 2011—2021年细菌VBNC研究领域关键词共现图Fig.2 Co-occurrence map of keywords in the research field of bacterial VBNC state from 2011 to 2021
2011—2021年细菌VBNC研究领域前30 个高频次关键词见表7。频次高的关键词主要是Escherichia coli（埃希氏大肠杆菌）、VBNC、nonculturable state（非可培养状态）、survival（存活）、resuscitation（复苏）、bacteria（细菌）、cell（细胞）和propidium monoazide（叠氮溴化丙锭）等，这些关键词在文献中被大量提及，是核心关键词，这些高频关键词反映了细菌VBNC研究领域的研究热点。
表7 2011—2021年细菌VBNC研究领域前30 个高频次关键词Table 7 Top 30 high-frequency keywords in the research field of bacterial VBNC state from 2011 to 2021
2.5.2 中介中心性关键词分析
由Cite Space 5.8软件得到的2011—2021年细菌VBNC研究领域前20 个中介中心性关键词表，如表8所示。关键词的中介中心性指的是一个关键词担任其他两个关键词之间最短连接桥梁的次数，能够反映某一关键词的媒介能力和桥梁作用[33]。
由表8可知，关键词按照中介中心性降序排序分别为复苏、非可培养状态、粪肠球菌、耐性、美国、沙门氏菌、诱导、空肠弯曲杆菌、细菌、创伤弧菌、消毒、表达、饥饿、毒性、废水、生长、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、流式细胞仪、创伤弧菌。中介中心性最高的关键词为复苏、非可培养状态、粪肠球菌，这些都是研究细菌VBNC文献中的核心关键词，在该领域发挥了核心枢纽的作用；
耐性、美国、沙门氏菌、诱导、空肠弯曲杆菌、细菌、创伤弧菌、消毒这些是中介中心性较高的关键词，在关键词共现图谱的网络结构中占据重要的中介位置；
其余中介中心性较低的关键词在表中没有体现，中介中心性为0的关键词不具备独立的中介作用，很大程度地依赖高中介中心性的关键词[32]。
表8 2011—2021年细菌VBNC研究领域前20 个中介中心性关键词Table 8 Top 20 betweeness centrality keywords in the research field of bacterial VBNC state from 2011 to 2021
2.5.3 关键词突现图分析
由Cite Space 5.8软件得到的2011—2021年细菌VBNC研究领域关键词突现图，如表9所示。关键词突现分析可以预测VBNC研究的前沿热点，突现强度越高，说明该关键词是该时间段内的研究热点[40]。
表9 2011—2021年细菌VBNC研究领域前20 个关键词突现图Table 9 Burst of keywords in the research field of bacterial VBNC state from 2011 to 2021
将表9中前20 个关键词翻译成中文，分别为创伤弧菌、群体、粪肠球菌、霍乱弧菌、饥饿、美国、压力应激、肠出血性大肠杆菌、活性、微生物、叠氮溴化丙锭、埃希氏大肠杆菌O157:H7、创伤弧菌、温度、氧化应激、嗜肺军团菌、活的不可培养状态、机制、快速检测、聚合酶链式反应。
从表9可以看出，2011年突现强度最高的关键词是vulnificus（创伤），表明创伤弧菌是2011年细菌VBNC领域的研究热点；
2013—2014年突现强度最高的关键词是cholerae（霍乱）；
2015年突现强度最高的关键词是viability（活性）；
2017年突现强度最高的关键词是Vibrio vulnificus（创伤弧菌）；
2019年突现强度最高的关键词是VBNC state（活的不可培养状态）。总体来看，vulnificus（创伤）、VBNC state（活的不可培养状态）和viability（活性）是突现强度最大的关键词，其次是temperature（温度）、Escherichia coliO157:H7（埃希氏大肠杆菌）、cholerae（霍乱）、Legionella pneumophila（嗜肺军团菌）、starvation（饥饿）、mechanism（机制）等，这反映出细菌VBNC在各个时间段的研究前沿热点。
查阅文献发现，上述结果和关于VBNC的文献综述描述[1,26-27]是相吻合的，本文的结果更具有可视化的优势和统计学意义。VBNC检测手段和机理探究依然是未来主攻方向之一[1,23-24,26]。为更科学地认识微生物、检测和消杀致病菌、利用有益菌，各国科学家们依旧还会在不同微生物进入VBNC条件、检测手段、抗性基因转移、形成机制等方面[1,25,28,41-43]开展大量的工作。另外，依靠现有技术培养的微生物仅占微生物总种类数的1%左右，而不可培养的微生物才是环境微生物多样性的主体。作为不可培养微生物资源的一部分，VBNC细菌最有可能突破培养条件限制，为其提供重要研究模型，这必将有助于开发这个极富利用潜力的巨大群体资源[19]。
基于Web of Science显示1994—2021年期间有关VBNC研究文献共911 篇，在文献搜索界面勾选Web of Science核心合集数据库，再勾选Article和Review两种类型后精炼出文献836 篇，占文献总数的91.77%。分析细菌VBNC研究的836 篇文献数据可得。
1994—2021年间有关细菌VBNC研究文献逐年呈现相对稳定增长趋势，发展势头良好。发文量排名前10 名的机构分别是美国北卡罗来纳大学、美国马里兰系统大学、法国国家农业食品与环境研究院、法国国家科学研究中心、浙江大学、华南理工大学、中国科学院、浙江师范大学、中国农业大学和中国科学院城市环境研究所。2011—2021年间中国发文量跃居世界第一。
从来源出版物来看，发文期刊主要集中在微生物、食品科学技术等领域，前10 名期刊处于细菌VBNC研究的布拉德福核心区。从研究方向来看，细菌VBNC研究涉及领域广泛，微生物学领域的研究和应用是持续受关注的研究方向。近11 年在微生物学、传染病学、基因遗传学及食品科技等领域发文量增幅明显，表明细菌VBNC在食品安全、科学技术、生物医学方面的研究越发受到重视。从研究热点看，活的不可培养、诱导、复苏、活性、叠氮溴化丙锭、大肠杆菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等关键词是被大家关注的热点。
在未来，随着经济社会的发展，人们对自身的健康日趋重视，食品安全性的提高和食源性疾病的预防备受关注；
加之人们热衷于挖掘和利用自然界中大量不可培养微生物，关于不同细菌VBNC的检测方法、形成机制、复苏机制研究需要更进一步的研究。细菌VBNC的深入研究必将吸引更多国家和不同领域的科学工作者的关注。这将会对食品安全、微生物资源的开发利用等重大问题的解决提供技术、理论支撑。