郭 琦 郭泽莉 吴文玉 孙 宁
1 中山大学中山眼科中心，眼科学国家重点实验室，广东省眼科视觉科学重点实验室(广州 510060)
2 广州市第一人民医院/华南理工大学附属第二医院(广州 510180)
细菌的耐药性问题被认为是当今所面临的最大科学挑战之一。例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、多重耐药金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌和多粘菌素耐药大肠杆菌等新型耐药菌的出现，严重降低了临床上常用的抗菌药物的疗效，曾经被普遍用来治疗常见的肠道与尿道感染、肺炎、新生儿感染以及淋病的抗菌药物，因为细菌对抗生素产生的超强抵抗力，已经逐步失去抑制耐药菌生长繁殖的能力，进而导致耐药菌感染患者的死亡率逐年增加，威胁人类的健康。另一个令人担忧的问题是新型抗生素的研发相对滞后。美国食品药品监督管理局批准上市的新抗生素药物近年来一直在減少, 从1962年起到现在, 只有3个新型抗生素药物(利奈唑胺、达托霉素和Retapamulin) 获批[1]。预计到2050年，全球因抗生素耐药性感染而死亡的人数估计将从2014年的70 万上升至1 000万，由此累计的医疗和生产力成本将达到100万亿美元[2]。鉴于耐药细菌对人类健康的威胁和临床用药选择范围的相对缩小，研发新作用机制和新化学结构的新一代抗菌药物，有效地杀死耐药细菌是解决这一全球性危机的重要举措。
近几年来，细菌的细胞分裂发生机制成为科研单位和药物企业研发新型抗生素的新方向。在目前已明确有效的靶点中，细胞分裂温度敏感突变体Z(filamenting temperature-sensitive mutant Z, FtsZ)是最具开发潜力和研究最为深入详细的作用靶点之一[3]。有关FtsZ蛋白的结构与功能研究揭示，它存在于绝大多数细菌中，具有高度的保守性，是介导细菌细胞分裂的关键蛋白。当其生物活性受到抑制时，细菌的细胞分裂将受到影响，进而导致细菌的生长繁殖被抑制。2008 年，英国Prolysis制药公司在Science上发表了能有效抑制MRSA生长繁殖的FtsZ蛋白抑制剂PC190723[4]。2012年，Merck制药公司在ScienceTranslationalMedicine杂志上详细阐述了该化合物的作用机制，并揭示了其与甲氧苯青霉素联合对抗MRSA的协同作用。目前，基于这一化合物的衍生物仍在进行前期的临床研究，有望开发成为新的抗菌药物。随着FtsZ蛋白在细菌分裂中的功能和作用机制的深入研究，越来越多生物医药研究者和药物开发公司，开始针对FtsZ蛋白着力开发新一代的抗菌药物。
FtsZ蛋白是细菌分裂增殖过程所必需的功能性蛋白，它存在于绝大部分原核生物中[5]。FtsZ蛋白的分子量约为40.3 kDa，许多FtsZ蛋白的高分辨的X单晶衍射晶体结构揭示了其具有两个结构域组成的保守结构(图1)[5]。N 端为核苷结合区(GTP结合位点)，而C端包含一个柔性很强的环(T7 loop)，这两个结构域由结构中央的H7 螺旋分隔开，由H5螺旋连接，形成小分子结合口袋(主要氨基酸有G193、G196、N263)。研究表明，FtsZ 以头接尾的模式聚合，一个单体的T7环会插入另一个单体的GTP结合位点，此时催化残基得以靠近γ-磷酸，从而催化GTP的水解[6]。
图1 FtsZ蛋白结构示意图
FtsZ蛋白的结构和功能角色与真核细胞的微管蛋白类似，具有一定的同源性，但是，微管蛋白的C端结构域更大。通过比较FtsZ蛋白与α-和β-微管蛋白的二维晶体结构，可以看出FtsZ蛋白和β-微管蛋白的GTP结合位点和C端在结构上有很强的相似性，所以FtsZ蛋白也被认为是微管蛋白的类似物。但两者在蛋白质氨基酸序列上只有7%的相似性，在核苷酸结合方式上也有很大不同。此外，微管蛋白是由α和β异二聚体组成，具有明显的极性，而FtsZ蛋白聚合物只由一个个FtsZ单体构成[3]。这些结构上的差异，为开发靶向FtsZ蛋白却又对微管蛋白无影响的药物提供了有效的条件。
细菌细胞的分裂是一个由多蛋白参与调控的复杂生物学过程，FtsZ蛋白在这一过程中起着至关重要的作用。在细菌启动细胞分裂时，FtsZ蛋白是第一个迁移到分裂位点的蛋白，通过GTP供能条件下首尾相接形成单条直链原丝蛋白，然后直链原丝蛋白平行相接形成FtsZ蛋白束，最后在细胞中部围绕细胞形成环状结构，相关领域的学者称这一过程为FtsZ蛋白的动态聚合，称这个环状结构为Z环。Z环形成后，会进一步招募其他细胞分裂蛋白(FtsA、ZipA、ZapA等)，通过蛋白-蛋白直接或间接作用形成细胞间隔膜。在FtsZ蛋白水解GTP提供的能量驱动下，Z环不断向内收缩，母体细胞进而一分为二成为两个子细胞(图2)[3,7]。这些发现为进一步研究FtsZ蛋白动态聚合的详细机制和基于蛋白结构的药物设计提供了可能。FtsZ 蛋白的动态聚合对Z 环的形成起着至关重要的调控作用。当FtsZ 蛋白的动态聚合或GTP 水解活性受到抑制时，Z 环将无法形成或无法保留其完整功能，即使细菌的DNA 复制和蛋白质合成等功能均运转正常，但细菌在此状态下只能形成狭长丝状(杆状细菌)或肥大球状(球状细菌)的形态，无法进行增殖分裂，从而导致细菌的死亡[3]。
图2 细菌分裂增殖示意图
随着对FtsZ蛋白的研究不断深入，医药研究者对其生物学功能的认识不断加深，开发靶向FtsZ蛋白的抗菌先导化合物也越来越受到研究者们的重视。目前，已有一些国内外研究团队在开展FtsZ蛋白抑制剂的研究，从现有的研究报道可以看出，当前FtsZ蛋白抑制剂主要包括天然产物及其衍生物和合成类抑制剂。
2.1 天然产物及其衍生物
2.1.1 黄连素及其衍生物 黄连素(图3)是一种常见的天然生物碱， 2008年，Dasgupta团队的研究发现黄连素可能是通过抑制FtsZ蛋白的GTP酶活性(IC50=16 μmol)和动态聚合(IC50=10 μmol)，起到抑制细菌生长的活性。分子模拟研究表明，黄连素的结合部位与大肠杆菌FtsZ蛋白中的GTP结合口袋相重叠[8]。Sun等人[9]通过基于FtsZ蛋白结构的设计方法，合成了一些9-苯氧基烷基黄连素的衍生物，分子对接的结果显示，这些衍生物的结合位点位于金黄色葡萄球菌FtsZ蛋白的C-末端结构域间隙。这类化合物具有较强的抗革兰氏阳性菌的活性，对MRSA和VRE的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值分别为2～8 μg/mL和4～16 μg/mL。此外，这些化合物对革兰氏阴性杆菌也表现出中等的抗菌活性，如大肠杆菌，其MIC值为32～128 μg/mL。在这些衍生物中，化合物2(图3)具有最强的抗菌活性，对MRSA和VRE的MIC值分别为2和4 μg/mL。此外，它还能抑制FtsZ蛋白的聚合和GTP酶的水解活性(IC50=38 μg/mL)。透射电子显微镜图像显示，该化合物能显著减小FtsZ聚合物的尺寸和厚度。
图3 部分天然产物及其衍生物来源的FtsZ抑制剂化学结构
2.1.2 肉桂醛及其衍生物 肉桂醛(图3)是一种从肉桂树皮中提取的天然芳香化合物。它能够抑制大肠杆菌FtsZ蛋白的GTP酶活性和动态聚合聚合，IC50值分别为5.81 μmol和6.86 μmol。分子模拟结果和STD-核磁共振的检测结果表明，肉桂醛结合在FtsZ蛋白的C-末端区域T7环周围的结合口袋中[10]。基于这个结果，Ma和他的同事合成了一系列肉桂醛衍生物，并测试了它们对革兰氏阳性和阴性细菌的抗菌活性。其中部分化合物能够抑制金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞分裂，作用浓度为0.25～4 μg/mL。其中含有2-甲基苯并咪唑和2，4-二氯苯基基团的化合物具有最强的活性 (化合物4)。生物活性测试的结果表明，这些化合物能够剂量依赖地抑制金黄色葡萄球菌FtsZ的聚合和GTP酶活性[11]。
2.1.3 Chrysophaentins Chrysophaentins A-H是Bewley等人从海洋大黄藻中分离得到的新的抗菌天然产物。这类化合物对几种革兰氏阳性细菌株都有很强的抗菌作用。其中，Chrysophaentins A(图3)对多种耐药菌均显示出很强的抗菌活性。例如，该化合物对MRSA和肺炎链球菌的MIC值分别为1.5 μg/mL和2.9 μg/mL。此外，它对大肠杆菌FtsZ蛋白的GTP酶有抑制作用，其IC50值为6.7 μg/mL，并能抑制FtsZ的动态聚合。进一步的GTPγS竞争性STD-核磁共振实验证明，该化合物能竞争性地结合在FtsZ蛋白的GTP结合位点[12]。基于这些结果，Bewley等人[13]合成改造了这类化合物，在GTP酶活性测定中，新化合物6对金黄色葡萄球菌FtsZ和大肠杆菌FtsZ的GTP酶活性均有抑制作用，IC50值分别为(38±9) μmol和(37±7)μmol。荧光靶向性实验结果表明，化合物6的结合位点也是FtsZ蛋白的核苷酸结合位点。
2.1.4 Viriditoxin Viriditoxin(图3)来源于绿垂曲霉。它能有效抑制大肠杆菌FtsZ蛋白的GTP酶活性和动态聚合，IC50值分别为7.0 μg/mL和8.2 μg/mL。对细菌形态的测定结果表明，该化合物能引起枯草杆菌的延长。此外，该化合物对许多耐药革兰氏阳性病原菌，如金黄色葡萄球菌(MIC值为4～8 μg/mL)、粪肠球菌和屎肠球菌(MIC值为2～16 μg/mL)均显示出较强的抗菌作用。此外，在细菌细胞中诱导FtsZ蛋白的高表达可以引起该化合物MIC值的升高，这表明在细菌菌株中，Viriditoxin具有靶向FtsZ的体内靶向性[14]。
除了以上所述的天然产物类抑制剂，还有姜黄素(图3)、秋水仙碱、白藜芦醇、紫杉烷及其衍生物等，这些天然产物都能够作用于FtsZ 蛋白，对FtsZ 抑制剂的研究工作有一定的指导意义[3]。
2.2 合成类FtsZ蛋白抑制剂
2.2.1 苯甲酰胺类衍生物 3-甲氧基苯甲酰胺(3-mercaptobutanoic acid，3-MBA)(图4)因为能显著抑制枯草芽孢杆菌的细菌分裂而被发现能在细菌体内靶向FtsZ蛋白[15]。鉴于3-MBA的低分子质量、良好的水溶性等优点，Czaplewski等人在500多个3-MBA衍生物的分子库中发现了化合物PC190723(10)。PC190723对枯草芽孢杆菌、MRSA、多药耐药金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌均有很强的抗菌活性。MIC值低至1 μg/mL。PC190723对金黄色葡萄球菌FtsZ蛋白的GTP酶活性具有剂量依赖性抑制作用，IC50值为55 ng/mL。细胞形态研究发现，经PC190723处理的杆状枯草芽孢杆菌的长度显著变长，而球形金黄色葡萄球菌的体积显著增大。表明细菌的细胞分裂受到明显的抑制。此外，研究还发现PC190723能干扰枯草芽孢杆菌细胞内Z环的形成。分子对接研究表明，PC190723结合在C末端和H7螺旋之间的结构域间隙上[4]。Andreu等人[16]发现，PC190723通过诱导和稳定FtsZ聚合物形成直束和条带，抑制了枯草芽孢杆菌FtsZ蛋白的GTP酶活性。Lumb等人通过FtsZ蛋白与PC190723的共晶体分析发现，PC190723结合在FtsZ蛋白的C末端结构域，并能稳定FtsZ的聚合形态，这一发现也验证Andreu等人的结论[17]。在后续的动物实验中，PC190723的药代动力学特征不甚理想，限制了它的进一步应用。Kate等人[18]在该化合物的基础上进一步改造出具有更好的代谢稳定性、药代动力学特性和抗菌功效的类似物TXA436、TXA707 和TXA709 (图4)。目前TXA709 正处于临床试验阶段，已经完成了首次人体Ⅰ期临床试验，并在2016 年9月被美国食品和药物管理局指定为合格传染病产品；
后续将加入额外的I 期人类安全临床试验，与临床抗生素联用进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的治疗。
图4 部分苯甲酰胺类FtsZ抑制剂化学结构
2.2.2 芳烃二醇-双没食子酸衍生物 Ruiz-Avila等人通过小分子与枯草芽孢杆菌FtsZ蛋白 GTP结合位点的分子对接方法，从化合物库中筛选出一系列与GTP竞争的FtsZ蛋白小分子抑制剂，并通过与MANT-GTP的竞争性实验，进一步验证这些小分子的靶向性。实验结果表明，UCM05(14)、UCM44(15)和UCM53(16)对细菌生长有明显的抑制作用，MIC值分别为100 μmol、25 μmol和13 μmol。此外，这三种化合物都能有效地诱导枯草芽孢杆菌细胞伸长并干扰Z环的形成[19]。根据这些化合物的结构，他们设计合成了一些小分子抑制剂，并评价了它们对细菌和FtsZ的抑制活性。最有效的化合物17(图5)显示出与FtsZ蛋白极强的结合亲和力(Kd=0.5 μmol)和对MRSA的抗菌活性(MIC值为7 μmol)。大多数芳烃二醇在100 μmol时对微管蛋白聚合几乎没有抑制作用，表明对该类化合物对FtsZ蛋白具有很高的选择性[20]。
图5 芳烃二醇-双没食子酸衍生物和嘧啶-奎宁类衍生物及其类似物的化学结构
2.2.3 嘧啶-奎宁类衍生物及其类似物 为了识别针对FtsZ的GTP结合位点的命中化合物，Wong等人[21]基于FtsZ蛋白的结构和功能特征，利用计算机药物辅助筛选软件，对20 000多种化合物进行了基于结构的虚拟筛选，并对筛选出的10个化合物进行了体外GTP酶抑制作用和对病原菌的抑菌活性测试。其中，化合物18(图5)对FtsZ蛋白(IC50=317 μmol)表现出中等的GTP酶抑制活性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值分别为449 μmol和897 μmol，其余9个化合物均无活性。在该化合物的基础上，他们扩大对结构类似物的筛选，成功发现了化合物19，其在生物学试验中显示出显著的活性改善。该化合物的GTP酶抑制活性(IC50=37.5 μmol)和对金黄色葡萄球菌(MIC=24.6 μmol)和大肠埃希菌(MIC=49.6 μmol)的抗菌活性均比27提高10倍以上[21]。此外，该化合物能够选择性地抑制FtsZ蛋白的活性，而不影响微管蛋白。抗菌实验还发现，该化合物能够恢复MRSA(ATCCBAA- 41)对β-内酰胺类抗生素的敏感性[22]。以该化合物为模版，Wong等人成功地合成了99个胺基连接的2，4，6-三取代嘧啶衍生物，并研究了它们的生物活性。对金黄色葡萄球菌的药敏试验结果表明，这些化合物具有较强的抗葡萄球菌活性(MIC值为3～8 μg/mL)。化合物14av_amine16(20)的STD-核磁共振、光散射和GTP酶活性实验表明，它通过抑制FtsZ的聚合和GTP酶活性起到抑制细菌分裂的作用。此外，枯草芽孢杆菌Z环和延长的细菌表型都揭示了该分子在细菌体内的FtsZ靶向特性。此外，14av_amine16不易引起金黄色葡萄球菌耐药株的产生，且对大额螟虫幼虫几乎没有毒副作用[23]。
2.2.4 喹啉衍生物 之前的研究表明，在血根碱中加入疏水取代基能够显著提高抗菌活性。LaVoie等人[24]进一步简化了血根碱的化学骨架，设计合成出一系列3-苯基异喹啉衍生物，用于抗菌活性评价。结果表明， 3′-位取代基的亲脂性与抗菌效果有关。化合物21(图6)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的MIC值分别为1 μg/mL和4 μg/mL。荧光滴定法的结果表明，该类化合物能与FtsZ蛋白相互作用，它们的离解常数范围为1～10 μM。此外，这些化合物对哺乳动物微管蛋白几乎没有影响，对哺乳动物细胞的毒性也很小。在上述喹啉类化合物研究的基础上，Sun等人对喹啉衍生物进行了研究。研究了N-甲基苯并吲哚并[3,2-b]喹啉和N-甲基苯并呋喃并[3,2-b]喹啉衍生物以及噻唑橙-喹啉衍生物22(图6)[25- 26]的抗菌活性。结果表明，这些化合物对MRSA和VRE等细菌具有较强的抗菌活性。生物化学研究结果表明，这些化合物通过抑制FtsZ蛋白的GTP酶活性，破坏了FtsZ蛋白的动态组装和Z环的形成，起到抑制细菌分裂的作用[25- 26]。
图6 部分合成类FtsZ抑制剂的化学结构
2.2.5 其他结构类型的FtsZ蛋白抑制剂 除了上述的合成类FtsZ 蛋白抑制剂，研究人员还发现OTBA、A189、zantrins(图6) 系列等合成类小分子能通过影响FtsZ蛋白起到抗菌效果[3]。OTBA是在81 个化合物中筛选出来的结构，它可以促进FtsZ 原丝组装，同时抑制其GTP 酶活性。氨基呋喃类的A189是通过无核细胞蓝色测定鉴定出来的，该实验能够有目的性地寻找抑制FtsZ 的GTP 酶活性的抑制剂，后续的研究表明A189 能抑制FtsZ 蛋白聚合，并且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较好的抑制作用。另外zantrin Z3通过抑制FtsZ 蛋白的GTP 酶活性和稳定FtsZ 原丝组装，进而使细菌细胞丝状化。
2.3 多肽类FtsZ蛋白抑制剂
在多细胞生物体中发现的一种由37个氨基酸残基组成的抗菌肽CRAMP，具有一定的抗菌活性，且能够诱导细菌细胞伸长，表明它可以抑制细菌胞质分裂。Ray等人[27]在此基础上，发现截短的CRAMP多肽片段(GEKLKKIGQKIKNFFQKL，16- 33)具有不错的抗菌活性和FtsZ抑制作用。该多肽在20 μmol和50 μmol浓度下均能完全抑制枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长。FtsZ的光散射实验表明，该多肽对FtsZ的聚合有剂量依赖性的抑制作用，并且不影响微管蛋白聚合。此外，该肽还降低FtsZ蛋白的GTP水解活性，抑制枯草芽孢杆菌的细胞分裂和Z-环的形成，导致细菌细胞伸长。Pieraccini等人[28]使用计算丙氨酸扫描技术(CAS)，识别FtsZ亚基之间蛋白质-蛋白质相互作用界面上的热点，设计合成了与FtsZ亚序列相对应的八肽，该八肽能干扰FtsZ蛋白自组装。随后，他们通过两种不同的环化方案对该多肽进行修饰，以限制其螺旋几何形状。这些环肽在FtsZ动态聚合的初始阶段具有显著的抑制作用。
目前的研究结果表明，FtsZ 蛋白是一个极具发展潜力的抗菌药物新靶点。主要表现在：(1)FtsZ蛋白是细菌生长繁殖的关键性蛋白。它在细菌细胞分裂和生长繁殖中必不可少，在调控细菌分裂增殖过程中起核心作用[3]。(2)FtsZ蛋白具有高度的保守性和相似性。绝大部分细菌中都发现含有FtsZ蛋白，包括各种耐药菌和肺结核杆菌等临床致病菌。在所有细菌分裂蛋白中，FtsZ蛋白的保守性和相似性最高，不易产生变异。因此，FtsZ蛋白抑制剂具有广谱抗菌活性，并且不易产生细菌耐药性[3]。(3)FtsZ蛋白只在细菌中特异性存在，虽然FtsZ 蛋白与人类的微管蛋白有类似的GTP 水解活性，但是两者的蛋白质氨基酸序列只有不到20%的相似度，在生物学结构和功能活性等方面存在很大的区别[3]。从已报道抑制剂情况可知，我们可以根据FtsZ蛋白的结构和生物学特性，设计靶向FtsZ蛋白的抑制剂，通过干扰FtsZ蛋白的动态聚合和GTP水解活性，高效专一地抑制细菌细胞的分裂，进而达到抑菌或灭菌的效果。
目前，虽然在FtsZ蛋白抑制剂上取得了一定的研究进展，但尚未有靶向FtsZ蛋白的抗菌药物进入二期临床试验。其原因可能是这些抑制剂虽然具有较好的体外抗菌活性，但仍存在毒副作用或体内分布代谢效果不理想等问题。另一方面，对FtsZ蛋白抑制剂的作用机制研究不够深入，也阻碍了靶向FtsZ蛋白的抗菌分子的结构改造和进一步开发。目前，大部分已知的抑制剂都只针对FtsZ蛋白进行了简单的机制探讨，鲜有在细菌体内深入探讨其作用机制，也没有深入研究化合物与FtsZ蛋白的具体结合模式。因此，仍需在不断扩大FtsZ蛋白抑制剂分子库的同时，深入探讨其作用机制，给临床上发现体内效果良好的靶向FtsZ蛋白的先导化合物提供坚实的理论基础。
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