刘计权，刘佳宁，王 宇，闫晓睿，薛帼珍，刘 昕
（1.山西中医药大学，山西 榆次 030619；
2.北京中医药大学，北京 102488）
2020版《中国药典》规定，中药柴胡来源于伞形科药用植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifoliumWilld.）的干燥根，分别习称为“北柴胡”和“南柴胡”［1］。目前，商品柴胡以北柴胡为主，其中80%以上来源于栽培，野生的不到20%［2］。现代研究表明，柴胡具有抗病毒、抗炎、解热、镇痛、提高免疫力、保肝利胆、降血脂等多种功效，柴胡皂苷是其发挥药效的主要物质基础［3］。
柴胡作为山西“十大”晋药之一，从南到北各县均有种植，总面积达到35万亩以上，其产量占全国产量的1/3左右。药用植物体内次生代谢产物的积累会受到海拔、温度、光照等多种生态因子的影响［4］，山西地形、气候复杂多样，各地差异悬殊，由于环境饰变必然会导致同种柴胡异地药材在质量上的不同［5-6］。本文通过收集山西不同产地柴胡药材与生态因子信息，利用HPLC测定柴胡皂苷含量，分析柴胡皂苷含量与生态因子的相关性，以期为山西柴胡的生态区划种植、品质提升提供参考依据。
供试药材：2019年通过野外踏查，从山西晋北、晋中、晋南、晋东南四个经济区选定11个柴胡种植的县域，并于同年11月分别采集11个产地的二年生柴胡药材，带回实验室50℃下烘干，粉碎，过四号筛备用。所有产地的药材经鉴定均为伞形科植物柴胡B. chinenseDC.的根。
试剂：柴胡皂苷a（批号：ST01270120，纯度为98.0%）、柴胡皂苷 c（批号：ST01280120，纯度为98.0%）、柴胡皂苷 d（批号：ST03880120，纯度为98.0%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；
甲醇、乙腈购自天津市科密欧化学试剂有限公司，均为色谱纯；
实验用水为娃哈哈纯净水。
仪器：Waters 2695高效液相色谱仪、Empower工作站、Waters 2998检测器（美国Waters公司）；
AlltimaTMC18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；
AB135-S型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；
AR323CN型电子分析天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；
HH-4-40276数显水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；
FW-100高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司），SB-5200DTDN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。
2.1 柴胡不同产地生态因子信息采集
在山西选定的11个柴胡种植基地（编号为S1-S11）进行野外踏查的过程中，运用 GPS（彩途-K20B）记录各产地的经纬度与海拔，气候因子通过查询当地气象台及借鉴中国气象数据网更新的最新数据。柴胡不同产地生态因子信息采集结果见表1。
表1 柴胡不同产地生态因子信息Tab.1 Ecological factors in different habitats of B. Chinense
2.2 柴胡皂苷含量的HPLC测定
2.2.1 对照品溶液的制备
分别精密称取柴胡皂苷a、c、d对照品2.61 mg、1.39 mg、2.07 mg放入1 mL容量瓶中，然后用1 mL甲醇完全溶解。将上述溶液移入5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，充分混匀后，作为混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密称取上述柴胡药材粉末约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入5%浓氨-甲醇溶液25 mL，密塞，称定质量，30 ℃水温超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用5%的浓氨甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 色谱条件
依据参考文献［7］的色谱条件进行测定。混合对照品和柴胡样品的HPLC色谱图见图1。
图1 混合对照品及柴胡样品的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance and sample
2.3 数据统计与分析
将获得的数据使用 Excel 2019软件进行处理，采用 SPSS 22.0进行主成分分析和Pearson 相关性分析。
3.1 不同产地柴胡皂苷含量测定结果
不同产地柴胡皂苷a、c、d的含量测定结果见表2。由表中结果可以看出，不同产地之间，柴胡皂苷a、c、d的含量具有一定的差异性。采自S7产地的柴胡，其皂苷a、d、a+d、a+c+d的含量显著高于其它产地，采自S6产地的柴胡中皂苷c的含量最高。2020版《中国药典》规定，柴胡皂苷a+d的含量不得低于0.30%［1］，本次测定的11个产地中，柴胡皂苷a+d的总含量介于0.285%～1.513%之间，产地S2、S8柴胡中柴胡皂苷a+d的含量低于0.30%，未达到《中国药典》规定的标准。
表2 柴胡皂苷含量测定结果Tab.2 Determination results of saikosaponin in B. Chinense （%）
3.2 环境因子主成分分析
3.2.1 生态因子原始数据标准化
利用SPSS 2019软件，将表1生态因子原始数据进行标准化处理，结果见表3。
表3 柴胡不同产地生态因子原始数据标准化Tab.3 Standardization of original data of ecological factors in different habitats of B. Chinense
3.2.2 主成分分析
利用SPSS分析软件进行主成分分析，结果见表4。从表4中提取特征值大于1、累计方差贡献率大于80%的成分作为主成分。由表4可知，前2个主成分的累计贡献率达到82.118%，因此提取2个主成分，分别设为Y1和Y2，计算得到各因子对原始7个指标数据的载荷情况，见表5。
由表5可知，主成分1中因子载荷量较大的变量分别是经纬度、无霜期和年均温，主成分2中因子载荷量较大的变量是年均日照。由表4可知主成分1方差贡献率为65.005%，主成分2方差贡献率为17.114%，所以主成分1中的经纬度、无霜期和年均温对柴胡生长的影响较为显著，主成分2中的年均日照变量对柴胡生长的影响较弱。
表4 评价因子主成分特征值和贡献率Tab.4 Principal component eigenvalue and contribution rate of evaluation factors
表5 各项评价因子载荷矩阵Tab.5 Load matrix of each evaluation factor
3.2.3 不同产地综合得分
利用软件和Excel计算柴胡不同产地综合得分并进行排序，由表6可知，山西各柴胡产地综合得分较高、排名居于前三位的依次是S7、S6、S5，结合表1生态因子调查结果和表2柴胡皂苷含量测定结果进行直观分析可以看出，S7、S6、S5这三个产地的生境特点为经纬度较高、无霜期较短、年均温较低，同时这三个产地柴胡皂苷a+d的含量相对较高。因此，初步推测在一定生境范围内，经纬度越高、无霜期越短、年均温越低的区域越有利于柴胡皂苷的积累。
表6 柴胡不同产地综合得分与排名Tab.6 Comprehensive score and ranking of different origins of B. Chinense
3.3 柴胡皂苷含量与生态因子相关性分析
表7相关性分析结果表明，总体来看，柴胡皂苷含量与经纬度、海拔呈正相关，与年均温、年均降雨量、年均日照和无霜期呈负相关。其中经度与柴胡皂苷a、c、d和a+d的含量呈显著正相关，纬度与柴胡皂苷a、d、a+d和a+c+d的含量呈极显著正相关，而无霜期与柴胡所有皂苷的含量均呈显著负相关。单就《中国药典》规定的柴胡皂苷a+d含量而言，经纬度、无霜期、年均温对其影响相对较大。
表7 柴胡皂苷含量与生态因子相关性Tab.7 Correlation between saikosaponin contents and ecological factors
药用植物的生长发育对环境有着极大的依赖性，不同产地的同种中药材，其药效成分的含量可能有所不同，这种差异取决于不同区域的生态条件。刘照东等［8］报道了11个省市29个样地柴胡中柴胡皂苷 a、c、d、e、f的含量均存在一定的差异性。光照和温度是影响药用植物生长发育最重要的环境因子，光照对药用植物生理生化都有重要的影响［9］。二年生西洋参中人参皂苷Rd、Rc和Rg1的含量会受到光照的影响［10］。马继良等［11］研究发现，曲靖烟叶总糖和总氮含量与产地纬度和海拔呈正相关，而与经度呈负相关。吕钦杨［12］报道，广西盾翅藤叶片中多糖、总氨基酸、总黄酮、总皂苷等的含量与产地海拔和年均降雨量成正相关，而与产地年均温和无霜期成负相关。但曾平生等［13］报道，华重楼根状茎中的总皂苷含量与产地海拔间呈高度负相关，皂苷Ⅶ与海拔呈中度负相关，而皂苷Ⅱ与年均温、皂苷Ⅵ与7月均温间均呈高度正相关，并且皂苷含量还与总酚酸和总黄酮含量具有一定的相关性。此外，陈千良［14］研究发现，“西陵知母”中知母皂苷AⅢ的含量与年均日照时数及7月均温呈现负相关。
本文研究结果显示，经纬度、年均温、无霜期是造成不同产地柴胡皂苷含量差异的主要生态因子，其中经纬度与柴胡皂苷含量呈正相关，而年均温、无霜期与柴胡皂苷含量呈负相关。与以往研究文献相比，同一生态因子对代谢产物积累的影响既有相同的结果，也有不同的结果。不同药用植物的代谢途径不同，进而产生的次生代谢产物不同，而且不同产地之间的生态因子复杂多样，各生态因子之间也会相互影响，如经纬度、海拔会对温度和光照产生影响，这些是导致同一生态因子对不同药用植物代谢产物积累影响结果不同的可能原因。不同产地中药材有效成分含量的差异性其实是在特定环境下多种生态因子综合作用的结果，所以在研究生态因子对中药材品质的影响时，要选择尽可能多的生态因子，同时还应充分考虑物种、次生代谢产物的种类，这样才能得出更加全面客观、科学的结论。
本文初步研究了山西产柴胡皂苷含量与部分生态因子的相关性，研究结果可为山西产柴胡优良品系筛选、生态区划种植、品质提升的深入研究提供一定的参考依据。
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