邱建强 黄 文 王玉玺 彭 凯*
(1.华中农业大学水产学院，武汉430070；
2.广东省农业科学院动物科学研究所，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，农业部华南动物营养与饲料重点实验室，广州510640；
3.加拿大农业与农业食品部莱斯布里奇研究中心，莱斯布里奇T1J4B1)
单宁是广泛存在于植物界的一类多酚化合物，属于植物次生代谢产物。长期以来，单宁被视为抗营养因子[1]，归因于单宁具有涩味、适口性差，且阻碍营养物质的消化吸收[2]。近年来，科学研究不断刷新人们对单宁的认识，目前认为单宁的作用具有“两面性”，这与单宁的来源、剂量、化学结构密切相关，如高剂量单宁普遍被认为是“抗营养因子”，而低剂量单宁则被认为是“有益因子”。单宁从传统认知的“抗营养因子”逐渐过渡到“有益活性物质”，归功于人们对单宁有益价值的深入探索，如发现适量单宁具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、促生长等生物活性，是理想的饲料添加剂和抗生素替代品[3]。
单宁可作为畜禽和水产动物的饲料添加剂应用于动物生产与保健。邓文等[4]研究表明，断奶仔猪饲粮中添加1 000 mg/kg栗树单宁可降低仔猪腹泻率，提高仔猪的生长性能和抗氧化能力。适量栗木单宁可提高滩羊生长性能，降低料重比，增加肌肉不饱和脂肪酸含量，提高肌肉营养价值[5]。耿昕颖等[6]发现，饲料中添加0.5%～1.0%醇提五倍子(富含单宁药用植物)可提高鳙鱼的非特异性免疫能力，对嗜水气单胞菌引起的感染具有抵抗作用。彭凯等[7]报道，凡纳滨对虾饲料中添加0.5～4.0 g/kg缩合单宁具有促生长、提高抗氧化能力作用。然而，当前研究主要集中在评价单宁的饲用价值及其对动物生长性能、营养物质消化率、抗氧化和免疫力、肉品质调控的作用效果，而对动物肠道健康和肠道菌群的研究有限。肠道是动物体内重要的消化吸收器官，也是最大的免疫器官，维持肠道健康是现代动物生产中的主要挑战。实际上，单宁可通过介导肠道微生物促进畜禽和水产动物的健康生长。Tosi等[8]研究表明，在肉鸡饲粮中添加板栗水解单宁能够有效控制坏死性肠炎，有效控制产气荚膜梭菌的增殖并降低肠道损伤程度。孙俊颖[9]报道，在雏鸡饲粮中添加0.4%单宁酸能够增加盲肠内产生短链脂肪酸微生物的相对丰度，提高短链脂肪酸含量，促进肠道黏液分泌，保护肠道免受机械损伤。郭慧等[10]报道，在凡纳滨对虾饲料中添加0.1%水解单宁，可降低对虾肠道中蓝细菌门、放线菌门和拟杆菌门的比例，增加变形菌门、软壁菌门和厚壁菌门比例，从而提高凡纳滨对虾的生长性能。本文综述了单宁介导动物肠道微生物调控动物生长和健康的研究进展，旨为单宁在畜禽和水产动物饲料中的应用提供参考。
单宁主要分为2类，即水解单宁和缩合单宁。水解单宁是由没食子酸或其衍生物与多元醇通过酯键形成的多元醇和酚羧酸，分子质量在500～3 000 Da[11]。许多植物器官中存在水解单宁，如五倍子、栗木、橡木、茶叶、花生等[12]。水解类单宁在酸、碱和酶的作用下易发生水解，生成简单化合物，根据水解所生成物质，又可分为没食子酸单宁和逆没食子酸单宁。缩合单宁是由黄烷-3-醇或黄烷-3，4-二醇通过4→8(或4→6)C-C键(或C-O-C键)缩合而成的聚合物[13]，其分子质量在2 000～4 000 Da，比水解单宁更大[14]。而缩合单宁在酸、碱和酶的作用下不易发生水解，这与缩合单宁的化学结构有关，但其在强酸作用下易缩合生成不溶于水的“鞣红”沉淀，如切开的水果和茶水放置过久时产生红色沉淀。水解单宁和缩合单宁的分子结构如图1所示。
A：水解单宁 hydrolyzable tannins; B：缩合单宁 condensed tannins。
目前，单宁的来源主要依靠化学提取和酶解提取，几乎没有人工合成的单宁。单宁的提取方法主要包含浸提法[16]、超声波提取法[17]、超临界流体萃取法[18]和微波提取法[19]等。彭凯等[20]的发明专利“一种植物缩合单宁的提取和纯化方法及其应用”(ZL202110079777.1)首次公开了采用酶解法提取植物中缩合单宁的技术方案，利用漆酶、纤维素酶、果胶酶等复合酶能够显著提高单宁的得率和纯度，避免化学试剂对环境造成的污染。实际应用过程中，要根据单宁的植物来源、产品纯度选择合适的提取方法，尽可能不影响单宁活性的前提下，达到高效、经济、环保的目的。
2.1 单宁的抑菌作用
单宁具有广谱抑菌性，尤其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜杆菌、芽孢杆菌等细菌具有抑制作用。单宁的抑菌机制主要包括：1)单宁与矿物质金属离子、蛋白质等形成螯合物阻碍细菌对此类物质的摄取，从而阻止其增殖[2]；
2)抑制胞外酶活性[15]；
3)单宁与细菌细胞壁结构成分结合从而破坏细菌细胞壁结构，与细胞膜作用影响膜电位、改变细胞膜的通透性[21]；
4)单宁抑制细菌生物膜的形成，减弱其对抗菌剂的阻隔作用和免疫清除作用[22]。
Dakheel等[23]报道，缩合单宁对体外禽致病性大肠杆菌具有显著的抗菌活性，其作用方式是抑制大肠杆菌游动和群集运动及其形成生物膜的能力。tumpf等[24]在单宁对大肠杆菌体外抑制试验中发现，其最小抑制浓度与培养基生长介质浓度有关，随着生长介质浓度增加，最小抑制浓度呈线性增加，证实单宁与培养基营养物质的相互作用在其抗菌活性中起着关键作用。据报道，单宁酸对体外金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌均具有很好的抑菌作用，其最小抑菌浓度分别为0.39和0.09 mg/mL[25]，说明单宁酸对不同菌种的抑菌效果不同。在体外厌氧条件下，添加200 μg/mL紫色达利菊缩合单宁能够显著抑制大肠杆菌的生长，电子显微镜下观察到大肠杆菌细胞膜增厚，且当缩合单宁浓度进一步提高时，细胞膜增厚效果更为明显，说明缩合单宁抑制大肠杆菌生长的作用机理可能是缩合单宁改变了细菌细胞膜的通透性[26]。综上所述，单宁的抑菌效果主要取决于单宁的浓度、介质浓度、菌种等因素，单宁主要通过改变细菌细胞膜结构产生抑菌作用。
单宁对革兰氏阳性菌的抑制效果通常优于革兰氏阴性菌，这与细菌的细胞结构有关。例如，Henis等[27]发现角豆水提单宁酸对大肠杆菌、产气杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用，而对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌(二者均为革兰氏阳性菌)的抑制作用更为明显。郑正男等[25]报道，当单宁酸浓度为12.5 mg/mL时，其对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草杆菌、青霉菌均具有抑制效果，但单宁酸对革兰氏阳性菌的抑制效果明显优于革兰氏阴性菌。形成这种差异的原因可能与不同细菌的细胞膜结构有关，相比革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌不具备外膜，单宁酸容易渗透，通过影响细胞膜的膜电位、物质转运功能和干扰胞内物质等方式实现更强的抑菌效果[22]。
2.2 微生物对单宁的降解作用
单宁虽然具有较强的抑菌活性，但某些细菌或真菌微生物却能够抵抗单宁的抑菌作用，甚至能降解单宁。单宁的微生物降解途径是通过微生物分泌单宁酶对其进行降解[28-29]。能够降解水解单宁的微生物主要有大肠杆菌、青霉属和曲霉属等菌类，水解单宁中的酯键在单宁酶的作用下，使水解单宁降解为棓酸(即没食子酸)和葡萄糖，而后在多酚氧化酶等其他酶作用下进一步分解为芳香族脂肪酸等小分子物质，降解物质可被机体吸收利用[29-30]。相比水解单宁，缩合单宁的分子质量大，结构复杂，不容易被降解[29]。研究表明，缩合单宁可以被某些真菌(如黑曲霉、米曲霉等霉菌)分解为黄烷醇单体，再进一步转化为酚类和酸类等小分子化合物[30]。然而，上述研究主要集中于单宁的体外微生物降解，有关畜禽和水产动物肠道微生物对单宁的降解作用及肠道内代谢产物的研究甚少，加强单宁与动物体内消化道微生物的互作研究，有助于深入解析单宁的营养调控作用机理。
3.1 单宁对猪肠道微生物的影响
水解单宁酸对仔猪腹泻、细菌性肠炎等疾病具有预防和治疗作用，其机制是通过竞争性抑制特定细菌生长代谢、繁殖和毒性作用，抑制肠道病原菌，增加有益菌数量[31]。如Brus等[32]研究表明，饲粮中补充栗木单宁可提高82～127日龄仔猪的生长性能，归因于栗木单宁降低仔猪肠道中大肠杆菌数量，增加乳酸菌数量。此外，单宁具有收敛性，能够减缓肠道蠕动，增加食糜在肠道中的停留时间，从而有利于营养物质的消化吸收[31]，如庞树坤[33]研究表明，在育肥猪饲粮中添加0.015%、0.030%、0.045%的单宁酸，猪的腹泻率显著下降。单宁预防猪的腹泻也可能与单宁抑制肠道病原微生物活动有关，据报道水解单宁酸可与蛋白质结合形成复合物，抑制微生物氮代谢，同时降低病原微生物发酵底物蛋白水平，抑制病原微生物生长，减少因病原微生物引起的腹泻状况发生[34]。Song等[35]报道，饲粮中添加0.1%五倍子单宁酸，可提高断奶仔猪盲肠芽孢杆菌的数量，并显著降低结肠大肠杆菌的数量，改善断奶仔猪的肠道健康。
3.2 单宁对鸡肠道微生物的影响
肠道黏膜屏障功能和肠道通透性对动物肠道健康至关重要。植物多酚类化合物一般通过调节肠道上皮细胞紧密连接、信号传导相关的肠道微生物而影响肠道通透性[36]。如从光雷等[37]报道，化香果单宁可能通过增加肉鸡肠道中副拟杆菌的相对丰度，保持肠道屏障完整性。李茜等[38]研究表明，在蛋鸡饲粮中添加1 g/kg水解单宁酸可促进盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖，抑制大肠杆菌生长，从而降低肠道通透性，改善蛋鸡肠道健康。另有研究发现，单宁酸或水解单宁主要通过调控鸡肠道乳酸杆菌和大肠杆菌数量，促进肠道健康，如张世忠等[39]报道，在白羽肉鸡饲粮中添加200 mg/kg单宁酸可促进肉鸡肠道乳酸杆菌属的生长。Jamroz等[40]发现，甜栗单宁显著降低28日龄鸡小肠中大肠杆菌的数量，明显改变了小肠和结肠中的微生物结构。李军辉等[41]研究表明，肉鸡饲粮中添加400 mg/kg水解单宁酸显著提高了盲肠中乳酸杆菌数量，降低了大肠杆菌数量。然而，鸡饲粮中添加水解单宁的报道较多，而对缩合单宁的相关研究较少，缩合单宁介导鸡肠道微生物对其生长、健康的影响有待进一步研究。
3.3 单宁对反刍动物瘤胃微生物的影响
由于反刍动物消化道较为特殊，瘤胃在营养物质消化吸收方面起着重要作用，有关单宁调控反刍动物肠道微生物的研究较少。单宁在反刍动物中的应用主要包括：1)单宁能够保护过瘤胃蛋白；
2)单宁调控瘤胃菌群抑制瘤胃气体产生，防止反刍动物发生胀气。单宁保护过瘤胃蛋白的原因主要是单宁与瘤胃内蛋白质形成“单宁-蛋白质”复合物，该复合物在pH为4.0～7.5可以保持相对稳定，瘤胃内正常pH为5.0～7.0，因此“单宁-蛋白质”复合物可以在瘤胃内不被细菌分解。当复合物经过小肠(pH 8.0～9.0)和真胃(pH 2.5)时，“单宁-蛋白质”复合物发生分解，蛋白质经酶降解后，被机体吸收利用[42]。
单宁可通过调控牛瘤胃微生物区系，降低甲烷产生，如吕忠蕾[42]报道，在延边黄牛饲粮中添加缩合单宁能够显著降低瘤胃中溶纤维丁酸弧菌和产甲烷菌的数量，抑制细菌对蛋白质的分解，减少甲烷的产生，提高蛋白质利用率。Díaz Carrasco等[43]研究表明，在荷斯坦牛饲粮中添加2 g/kg的栗木单宁和白坚木单宁，瘤胃中厚壁菌门和拟杆菌门的比值增加，单宁改变了瘤胃中纤维分解菌、淀粉分解菌和尿素分解菌的结构组成，减少了产甲烷菌数量。Pieiro-Vázquez等[44]报道，在小母牛饲草中加入80%的银合欢(含缩合单宁的豆科灌木)，能够减少61.3%的肠道甲烷排放，而不影响干物质、有机物质的摄入量和瘤胃液中的原生动物种群。单宁降低瘤胃甲烷产量的原因也可能与单宁直接抑制产甲烷菌有关，如常玮学等[45]研究表明，秦川肉牛饲粮中添加3.22、6.44、9.66和12.88 g/kg的水解单宁，蛋白质利用率逐渐提高，瘤胃甲烷杆菌的相对丰度逐渐降低。李志威[46]研究表明，饲喂百脉根干草及其缩合单宁降低了湖羊瘤胃的发酵性能，减少了产甲烷菌和主要纤维蛋白降解菌的相对丰度，但不改变瘤胃微生物的整体结构。综上所述，单宁主要通过抑制反刍动物瘤胃蛋白质和纤维素分解菌及产甲烷菌的数量，促进瘤胃氮代谢，减少甲烷排放。
3.4 单宁对鱼类肠道微生物的影响
饲料中添加适量多酚可提高草鱼[47]、石斑鱼[48]、鲈鱼[49]、大菱鲆[50]的生长性能、抗氧化能力、肌肉品质和免疫力。然而，有关单宁对鱼类肠道微生物影响的研究较少。水产动物肠道微生物中丰度最高的为变形菌门，其丰度过高会破坏肠道微生态环境，增加患病害的可能性[51]，如姚静婷[52]研究表明，草鱼可耐受饲料中1.25%的水解单宁，水解单宁改变了草鱼肠道微生物的组成，表现为肠道变形菌门的相对丰度降低，从而有益于肠道健康。水产动物主要依靠非特异性免疫抵御病原菌，单宁可增强鱼体对致病菌的抵抗。朱旭枫等[53]研究表明，在珍珠龙胆石斑鱼饲料中添加0.1%的水解单宁，可增加肠道放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门比例，降低变形菌门比例，促进营养物质的转换和吸收，从而提高石斑鱼的免疫力和生长性能，降低患病率。Ma等[54]报道，饲料中添加茶多酚最适水平120 mg/kg，改善了草鱼嗜水气单胞菌攻毒引起的肠道损伤，一方面可能归因于茶多酚可能通过凝固病原体内原生质和酶，影响微生物生长代谢[55]，抑制了嗜水气单胞菌生长；
另一方面可能归因于茶多酚提高了肠道抵抗氧化应激能力，降低了氧化损伤产物，减缓了肠道损伤[54]。龙萌等[56]研究表明，在团头鲂幼鱼饲料中添加50 mg/kg茶多酚，嗜水气单胞菌攻毒后团头鲂成活率显著提高，说明茶多酚对嗜水气单胞菌具有明显的抑制效果。单宁还可以通过激活细胞Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件(Keap1-Nrf2/ARE)抗氧化信号通路，上调下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因表达水平，提高动物的抗氧化应激能力[57]。单宁能够增加鱼类肠道有益菌，抑制有害菌，从而调节鱼类肠道微生态平衡，促进动物肠道健康，如Peng等[58]研究表明，饲料中添加400 mg/kg缩合单宁显著改变了海鲈的肠道菌群结构，缩合单宁通过增加细菌菌属梭菌属和螺旋体属相对丰度，降低气单胞菌属相对丰度，从而减少肠道内毒素的分泌，改善海鲈肠道通透性，提高肠道健康水平。
肉食性鱼类对糖的利用能力差，通过单宁介导肠道微生物降血糖，可以增加鱼类对糖类的利用率。植物多酚与肠道菌群相互作用可以起到降血糖作用，其作用机制为：1)抑制病原菌生长从而提升益生菌数量，抑制细菌黏附肠道细胞，防止肠道菌群失调导致肠道黏膜屏障调节能力减弱，细菌产生脂多糖等有害代谢物质进入血液，引发代谢性内毒素血症，有害代谢物质与肝脏及脂肪细胞上细胞因子受体结合，诱导释放炎症因子及发生胰岛素抵抗[59]；
2)促进肠道激素的分泌，肠道微生物代谢产生短链脂肪酸，短链脂肪酸可以促进肠道内分泌细胞分泌胰高血糖素样肽肠肽-1、胰高血糖素样肽-2、酪酪肽等肠源性激素，影响机体对胰岛素敏感程度，改善胰岛素抵抗，调节机体血糖水平[59]。
3.5 单宁对甲壳动物肠道微生物的影响
凡纳滨对虾的肠道优势菌主要以变形菌门和蓝细菌门为主，其次是放线菌门和拟杆菌门[10]。放线菌门属条件致病菌，放线菌在机体免疫能力低时侵染引起疾病发生[51]。李青霞等[60]研究表明，凡纳滨对虾饲料中添加五倍子提取物对副溶血弧菌具有抑制作用，其抑制效果与其提取方法有关，水法提取和醇法提取的最好抑制效果含量分别为1%和0.5%。陈啟康等[61]报道，在凡纳滨对虾饲料中分别添加300、600和900 mg/kg栗木单宁，肠道中变形菌门比例逐步降低，而拟杆菌门比例逐步升高。朱旭枫[62]研究表明，凡纳滨对虾饲料中添加0.15%水解单宁，增加了对虾肠道厚壁菌门的相对丰度，降低了放线菌门和拟杆菌门的相对丰度，改善了肠道菌群结构，同时提高了凡纳滨对虾的生长性能和抗病力。由此可见，单宁通过增加肠道有益菌和抑制腐败菌的方式，促进甲壳动物肠道健康，控制肠道微生态平衡。
单宁能够抑制水体中的致病菌，对感染蟹类的病原微生物具有抵抗作用。邱庆连等[63]研究表明，在五倍子、乌梅、天冬、秦皮等中草药提取物对锯缘青蟹致病弧菌体外抑菌试验中发现，五倍子提取物(富含单宁)的抑菌效果最好，其对拟态弧菌、梅氏弧菌、霍利斯弧菌的最小抑菌浓度分别为0.172、0.172和0.086 mg/mL。Wu等[64]报道，对于感染副溶血弧菌的拟穴青蟹，采用20 mg/mL五倍子提取物进行药浴，可有效降低死亡率。由此可见，富含单宁的中草药是预防和治疗蟹类细菌病的良好选择。
单宁是普遍存在于植物界的多酚类化合物，主要分为水解单宁和缩合单宁，二者均具有显著的抑菌活性。适量单宁不仅不影响动物的生长性能，还能通过调控肠道微生态平衡，维持动物肠道健康，是理想的饲料添加剂和抗生素替代品。单宁介导畜禽和水产动物肠道菌群可调控营养物质的代谢，增强对疾病的抵抗力，提升动物的健康水平。后续研究应重点加强单宁与肠道微生物的互作关系研究，进一步揭示单宁调控肠道健康的微生态机理，为单宁的饲料化应用和抗生素替代品的开发提供理论依据。
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