冯 鑫 栾嘉明 杨东旭 张 敏 金英海 耿春银*
(1.延边大学农学院，延吉133000；
2.延边大学东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，延吉133002)
由于瘤胃微生态系统的复杂性和多样性，反刍动物能够利用单胃动物难以消化的部分饲料。瘤胃微生物独特的酶和酶复合物可以将摄入的营养物质转化为供机体利用的脂肪酸、微生物蛋白、维生素和微生物细胞等，这种独特的消化方式使反刍动物能够将膳食纤维转化为对人类有益的动物产品(如肉类和奶类)。活性干酵母(active dry yeast,ADY)已广泛应用于反刍动物，其可通过与瘤胃内的其他微生物竞争，影响瘤胃发酵活动，提高饲料效率并防止瘤胃酸中毒，以有效地改善反刍动物的瘤胃环境，促进生长，预防健康障碍，部分酵母产品在欧洲已被正式授权为饲料添加剂[1-2]，但有关ADY对肉牛胴体性状和肉品质影响的报道仍然有限。肌肉的特征，如肌纤维的横截面积、代谢酶活性、胶原蛋白含量和溶解度以及脂肪含量，都或多或少地解释了肉品质的可变性[3]。之前的研究表明，添加ADY提高了育肥公牛肉的嫩度和阉牛的胴体质量等级[4-5]，其对牛肉嫩度的改善与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和减少氧化应激有关[6]。MMPs是一类可降解细胞外基质成分的酶，参与调节可溶性胶原蛋白的比例、脂肪细胞的分化和牛肉大理石花纹的形成[6-7]。考虑到酵母反应因所用酵母菌株、饮食性质和动物生理状态等因素而异，有关ADY对牛肉品质的影响机制仍需要继续深入探讨。因此，本试验通过研究补饲ADY对延边黄牛生长性能、屠宰性能、肉品质、血清和牛肉中MMPs浓度的影响，以进一步阐明ADY调控肉品质的机制，并为其在肉牛生产中的应用和开发提供理论依据。
1.1 试验设计
试验于2020年11月至2021年2月在吉林省龙井市牧乐牧业有限公司进行。选取初生体重(485±38) kg的延边黄牛(公牛)20头，随机分为2组，分别为CON组和ADY组，每组10头。CON组饲喂基础饲粮[为全混合日粮(TMR)形式]，ADY组在饲喂基础饲粮的基础上补饲ADY[菌株为酿酒酵母CNCMI-1077(SaccharomycescerevisiaeCNCMI-1077)，活菌数≥8.0×109CFU/g]，ADY以制造商建议的1 g/(头·d)的剂量提供。试验期共计100 d，其中预试期10 d，正试期90 d。基础饲粮组成及营养水平如表1所示。
表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)
1.2 饲养管理
在试验开始之前，对牛舍进行清扫、消毒，给牛打好耳号、驱虫。所有牛采用栓系式饲养，每天饲喂2次，自由采食和饮水。饲喂后清扫圈舍，定期对牛舍通风和消毒，保证管理方式和饲养条件一致。
1.3 样品采集
试验结束前1天，待肉牛空腹12 h后，对每头牛颈静脉采血10 mL于采血管中，4 ℃静置过夜，后经20 min、3 000 r/min离心分离获得血清。试验结束后，试验牛空腹12 h后进行屠宰，排酸24 h后进行胴体分割，取牛背最长肌(西冷)部分的肉样。将采集到的样品于-80 ℃保存，用于后续指标的测定。
1.4 测定指标及方法
1.4.1 生长性能
正式试验开始及试验结束的前1天，待肉牛空腹12 h进行称重，试验期间记录每天的供料量和剩料量。测定的生长性能指标包括初始体重、终末体重、平均日增重、干物质采食量和饲料转化率。
1.4.2 屠宰性能
试验结束时，肉牛在禁食12 h后进行屠宰，记录宰前活重和胴体重。每头牛的屠宰率通过计算胴体重与最终活体重的比率获得。在胴体切割过程中，用游标卡尺测量第12肋骨皮下脂肪厚度。在透明硫酸纸上绘制眼肌的横截面图后，使用QCJ-2000求积仪(哈尔滨光学仪器厂)测量眼肌面积。使用AUS-MEAT大理石花纹参考标准(2005)的0～9评分范围评估大理石花纹评分。
1.4.3 肉品质指标
物理指标：pH使用手持pH计(Eutech Instruments,美国)测定。肉色使用Minolta-CR400/410便携式色差仪(日本)测定。剪切力使用Warner-bratzle-2356x剪切力仪(Salter Brecknell,美国)测定。将牛肉切成尺寸为15 mm×15 mm×30 mm的小块，4 ℃悬挂24 h测定滴水损失。将牛肉真空包装在聚乙烯袋中，于80 ℃下加热直到内部温度达到70 ℃，用于计算蒸煮损失。取在10%甲醛溶液固定24 h以上的肌肉组织，流水冲洗24 h，梯度酒精脱水，1/2二甲苯+1/2无水乙醇和纯二甲苯脱色，将处理好的组织浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、苏木精-伊红(HE)染色和中性树胶封片，Olympus-DP73显微镜(日本)下拍照，观察肌肉组织形态。使用图片分析软件ImageJ统计牛肉的肌纤维密度和肌纤维直径。用肌纤维根数除以肌纤维束所占面积求得肌纤维密度。以肌纤维束所占面积除以肌纤维根数求得平均面积，将其拟合成圆求得肌纤维直径。
化学指标：通过测量羟脯氨酸含量反映胶原蛋白含量。参照李华[8]和马元婧等[9]的方法提取和测定肉样中总羟脯氨酸和可溶性羟脯氨酸含量，按照Crouse等[10]推荐的系数计算总胶原蛋白和可溶性胶原蛋白含量，并根据总胶原蛋白和可溶性胶原蛋白含量计算胶原蛋白溶解度(胶原蛋白溶解度=100×可溶性胶原蛋白含量/总胶原蛋白含量)。牛肉中蛋白质含量的测定使用凯氏定氮仪分析法(Kjeltec-8400,FOSS,丹麦)，水分含量的测定使用直接干燥法，肌内脂肪含量的测定使用索氏提取法，灰分含量的测定使用称重法。
1.4.4 MMPs浓度
血液和牛肉中MMP-2、MMP-9和MMP-13浓度根据制造商的说明采用双抗体夹心法测定，所用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(货号分别为ml063746、ml063748和ml002505)购自上海酶联生物科技有限公司。测定前，牛肉需用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01 mol/L，pH=7.4)冲洗组织，去除残留液体，称重后将组织剪碎，按1 g组织样本对应9 mL PBS的比例加入PBS，使用组织匀浆机于冰上进行研磨，将匀浆液于10 min、5 000 r/min离心，取上清液进行测定。
1.5 统计分析
生长性能数据采用SPSS 21.0软件中的一般线性模式中的协方差分析，模型显著时，平均值采用估计值，模型不显著时，平均值采用真实值。屠宰性能、肉品质和MMPs浓度数据使用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05表示差异显著，0.05 由表2可知，与CON组相比，ADY组的DMI显著提高(P<0.05)，其他生长性能指标均无显著变化(P>0.05)。 表2 补饲ADY对延边黄牛生长性能的影响 由表3可知，与CON组相比，ADY组牛肉的大理石花纹评分显著提高(P<0.05)，其他屠宰性能指标没有显著变化(P>0.05)。 表3 补饲ADY对延边黄牛屠宰性能的影响 由表4可知，在牛肉的物理指标方面，与CON组相比，补饲ADY显著降低了剪切力(P<0.05)，趋于减小肌纤维直径(P=0.071)，趋于增加肌纤维密度(P=0.067)，但对pH、蒸煮损失、滴水损失和肉色均无显著影响(P>0.05)。在牛肉的化学指标方面，与CON组相比，补饲ADY显著增加了胶原蛋白溶解度(P<0.05)，趋于增加肌内脂肪含量(P=0.067)，但对水分、蛋白质、灰分、总胶原蛋白和可溶性胶原蛋白含量没有显著影响(P>0.05)。肌纤维组织形态见图1。 表4 补饲ADY对延边黄牛肉品质的影响 图1 肌纤维组织形态 由表5可知，与CON组相比，补饲ADY显著增加了延边黄牛血清中MMP-2、MMP-9和MMP-13的浓度(P<0.05)。与CON组相比，ADY组牛肉中MMP-2浓度显著升高(P<0.05)，MMP-9和MMP-13浓度无显著变化(P>0.05)。 表5 补饲ADY对延边黄牛血清和肌肉中MMPs浓度的影响 ADY对反刍动物的生产力和健康水平具有一定的促进作用。一些关于生长性能的研究显示，添加ADY可以提高肉牛的终末体重、平均日增重和平均日采食量[4]，但也有研究发现，补饲ADY会降低肉牛的采食量或对肉牛的生长性能无显著影响[11-12]，造成结果差异的原因与动物的生理状态、饲粮的组成和酵母菌株的种类等有关。本试验结果显示，补饲ADY显著提高了延边黄牛的DMI，这可能与其对纤维降解菌的调控作用和胃饥饿素(ghrelin)等采食相关激素的调节有关[13-14]。据报道，较低营养水平的饲粮中添加ADY，肉牛能够产生与高营养水平饲粮相似的胴体重[15]，说明ADY能够一定程度地改善肉牛的屠宰性能。本试验条件下，补饲ADY后牛肉大理石花纹评分显著上升，但未对延边黄牛的宰前活重、胴体重、屠宰率、眼肌面积和第12肋骨皮下脂肪厚造成显著影响，与Magrin等[16]和李月明[17]的研究结果相似，这提示添加ADY可能对牛肉脂肪的沉积具有一定的调控作用。 剪切力是衡量肉品嫩度的参数之一。通常，剪切力的数值越低，牛肉的嫩度越好。Geng等[4]研究发现，补饲ADY对牛肉的pH、滴水损失、蒸煮损失、肉色均无显著影响，但显著降低了牛肉的剪切力，这与本试验结果一致。肌纤维的某些指标与肌理特性相关，也可以反映肉品的嫩度。研究发现，肌纤维直径与肌肉的剪切力和失水率成正比，与pH、大理石花纹评分和肌间脂肪含量成反比，而肌纤维密度则与之相反[18-19]。一般而言，肌纤维直径较小，肌纤维密度较大，肉越嫩[20]。已有相关的研究报道，补饲酵母制剂可显著降低肉鸡[21]和肉鹅[22]的肌纤维直径，改善肉品嫩度。在本研究中，与CON组相比，ADY组肌纤维密度增加，肌纤维直径减小，这有利于牛肉嫩度的改善。据报道，补饲抗氧化剂可改善肉的嫩度并影响肌纤维特性[23]，牛肉中抗氧化酶的活性与肌纤维直径呈负相关关系[18]，而补饲ADY能够提高肉牛机体的抗氧化能力[17]，由此推测，ADY对肌纤维的调控可能与其对肉牛抗氧化能力的改善有关。 根据相关报道，补饲ADY可提高乳脂的含量，同时其还具备改善牛肉脂肪酸谱和肌内脂肪沉积的功效[24-25]，说明ADY可以通过影响肉牛的脂代谢，进而影响畜产品的质量，这可能是本研究中ADY组肉牛肌内脂肪含量提高的原因。胶原蛋白是一种主要的细胞外基质成分，其含量和溶解度是导致肉的嫩度和质地变化的因素之一[26]。Warner等[27]提出总胶原蛋白含量在预测肉的嫩度时的价值有限，而胶原蛋白的溶解度预计会影响嫩度。氧化应激可能会减少肌肉中肌内成纤维细胞对新胶原蛋白的合成，这可能导致胶原蛋白溶解度降低和肉的韧性增加[7]，而ADY对牛肉嫩度和肌内脂肪含量的积极影响可能是通过提高肉牛机体抗氧化能力实现的[6]。本研究发现，ADY组牛肉的胶原蛋白溶解度较CON组显著提高，进一步说明补饲ADY对牛肉嫩度具有改善作用。 MMPs是一类可降解细胞外基质成分的蛋白酶，MMP-2和MMP-9(明胶酶)、MMP-13(胶原酶)已被证实参与肌肉、纤维、脂肪和结缔组织的发育等生物学过程[7,28]。抗氧化剂可以显著增加肌肉中MMPs的表达，并可能潜在地促进结缔组织的周转，改善肉的嫩度[7]，而结缔组织蛋白、肌原纤维蛋白的结构和可降解性是影响牛肉嫩度的关键的因素[29]。位于肌内结缔组织中的肌内脂肪，可通过MMPs重塑结缔组织，并由成纤维细胞合成新的细胞外基质成分，这是肌束间和肌束内脂肪沉积所必需的[28]。据报道，MMPs还参与脂肪细胞分化的调节[30]，由于脂肪细胞和成纤维细胞来源于共同的间充质细胞，促进脂肪的生成会导致更多的脂肪细胞和更少的成纤维细胞，这可能会使动物肌肉中形成更多大理石花纹，而减少结缔组织的形成，并影响肉的嫩度[31]。之前的研究发现，血清中MMP-2的浓度与牛肉的大理石花纹评分呈正相关，MMP-9和MMP-13的浓度与牛肉的剪切力呈负相关[32]。在本研究中，补饲ADY显著增加了肉牛血清中MMP-2、MMP-9和MMP-13以及牛肉中MMP-2的浓度，与Geng等[6]的研究结果相似，强调补饲ADY后牛肉的肌内脂肪沉积、嫩度、肌纤维特性和胶原蛋白溶解度的变化可能与MMPs浓度的增加有关。 本试验条件下，补饲1 g/(头·d)的ADY可提高延边黄牛的采食量和肌肉大理石花纹评分，ADY可能通过增加MMPs的浓度、胶原蛋白在牛肉中的溶解度以及肌内脂肪的含量，改善肌纤维密度和肌纤维直径，进而影响牛肉的嫩度。2.1 补饲ADY对延边黄牛生长性能的影响
2.2 补饲ADY对延边黄牛屠宰性能的影响
2.3 补饲ADY对延边黄牛肉品质的影响
2.4 补饲ADY对延边黄牛血清和牛肉中MMPs浓度的影响
