赵 静 黄珺霞 唐秀花 王 红
肺鳞状细胞癌是一种常见的癌症[1]。近年来，随着临床技术的不断发展，肺鳞状细胞癌的诊疗方法相比以前有了一定的进步[2, 3]。然而，手术、化疗和放疗等常规治疗方法由于转移、复发和耐药等原因，并没有明显提高晚期患者的生存率[4, 5]。因此，深入研究和阐明肺鳞状细胞癌的发生机制，对于该类疾病的诊治具有重要意义。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)在癌症的发生、发展过程中发挥了重要的作用[6～9]。研究发现，lncRNA在肺鳞状细胞癌中处于异常表达的状态，提示其可能与肺鳞状细胞癌的发生、发展和预后相关。例如，LINC00511在肺鳞状细胞癌中作为癌基因而发挥作用，有可能成为肺鳞状细胞癌患者诊断的生物学标志物和治疗靶点[10]。此外，lncRNA HOXA11-AS被确定为多种人类癌症病理过程中的致癌基因，如胰腺癌和结直肠癌[11，12]。提示其可能在癌症相关疾病中发挥着重要作用。然而，尚不清楚HOXA11-AS在肺鳞状细胞癌中是否也具有重要的调控作用。非编码小分子RNA(micoRNA，miRNA)是一类内源性非编码短RNA，其长度为19～25个核酸，可与3′-非翻译区结合，转录后可通过与mRNA结合，导致基因沉默[13, 14]。此外，据报道，miR-149-3p可以抑制某些人类癌症的发生和发展，如骨肉瘤[15]。但是，miR-149-3p是否可作为HOXA11-AS的下游分子而介导肺鳞状细胞癌的发展鲜见报道。SPT16是染色质转录促进复合体的重要组成部分，是一种组蛋白伴侣，其在基因转录、DNA复制和DNA修复过程中发挥重要作用。有趣的是，SPT16可以作为肺癌的预后指标[16]。然而，SPT16在肺鳞状细胞癌中的作用尚不清楚。
因此，笔者研究了HOXA11-AS的表达水平及其对肺鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡和转移以及肿瘤生长的影响，以及其与miR-149-3p和SPT16在肺鳞状细胞癌可能的调控机制。
1.组织来源：收集2018年6月～2019年6月收治于笔者医院的肺鳞状细胞癌患者手术切除癌组织和癌旁组织30例。在切除手术中获得癌组织及对应的相邻正常组织，并立即保存在液氮容器中。所有受试者均符合肺鳞状细胞癌的诊断标准，术前均未接受放疗、化疗或其他治疗。所有患者均签署知情同意书，本研究已通过笔者医院医学伦理学委员会审批。
2.细胞培养和转染：人肺鳞状细胞癌细胞系NCI-H226、NCI-H520、SK-MES-1和正常肺上皮细胞系BEAS-2B购自中国科学院细胞所(上海)。所有细胞均用含8%胎牛血清(以色列BI公司)的DMEM培养基(美国Gibco公司)培养在37℃含5% CO2的恒温培养箱(美国Thermo公司)中。
靶向HOXA11-AS的小干扰RNA(siRNA)(si-HOXA11-AS)及其阴性对照(si-NC)、miR-149-3p 抑制剂(anti-miR-149-3p)及其阴性对照miR-NC抑制剂(anti-miR-NC)、miR-149-3p mimics (miR-149-3p)及其阴性对照miR-NC mimic (miR-NC)由中国上海基因制药有限公司设计合成。对于HOXA11-AS和SPT16的过表达，由汉恒生物技术有限公司(中国上海)构建相应的过表达质粒pcDNA-HOXA11-AS (HOXA11-AS)，同时，以非靶向质粒(pcDNA)为阴性对照。根据用户手册，使用Lipofectamine 3000将上述寡核苷酸或质粒转染到肺鳞状细胞癌细胞NCI-H520中。
3.定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)：使用RNA分离试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)从肺鳞状细胞癌组织和配对的相邻正常组织、肺鳞状细胞癌细胞中分离总RNA。对于互补DNA (cDNA)的合成，使用1μg RNA，借助高容量cDNA反转录试剂盒。选用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix检测HOXA11-AS和SPT16mRNA的表达。miR-149-3p分析使用all-in-one MIRNA RT-qPCR试剂盒。HOXA11-AS、miR-149-3p和SPT16的相对表达采用2-ΔΔCt方法进行评估。RT-qPCR研究中涉及的引物序列详见表1。
表1 RT-qPCR引物序列
4．MTT细胞增殖测定：用四甲基偶氮唑盐细胞活力分析试剂盒(美国Sigma公司)检测细胞活力。将转染后的细胞接种于96孔板(200μl，3×103个/孔)。每孔加入10μl四甲基偶氮唑盐(5mg/ml)继续孵育4h，沉淀溶解于二甲基亚砜(100μl)中。在分光光度计下于490nm波长处测定吸光度(A)值。
5.Transwell实验：细胞被胰酶消化，并放置在上室中，其中包含非涂层膜。下室加入600μl 1%胎牛血清。37℃孵育24h后，用棉签去除膜的上表面，而下表面的细胞用0.1%结晶紫染色30min。为了进行侵袭试验，按照试剂说明进行Matrigel小室实验。收集转染组细胞(200μl，5000个/孔)，悬浮于无血清培养液中，移入50μl的小室。在含10%胎牛血清的500μl DMEM培养液中培养过夜。将上表面的细胞刮去，将下表面的侵袭细胞固定，用0.1%结晶紫染色半小时。
6.双荧光素酶报告基因试验：利用miRcode和target Scan Human7.2在线软件预测HOXA11-AS、miR-149-3p、SPT16的相互作用关系。构建了含有miR-149-3P野生型(WT)和突变型(MUT)结合位点的荧光素酶表达载体。进一步，将SPT16基因3′-UTR上miR-149-3p的WT或MUT结合位点克隆到pmirGLO载体(美国Rromega公司)中，构建了WT或MUT SPT16 3′-UTR荧光素酶表达载体。用脂质体2000将荧光素酶报告基因与miR-149-3p mimics和阴性对照分别共转染入NCI-H520细胞。转染48h后，用双荧光素酶报告分析系统(Promega)检测荧光素酶的相对活性，用萤火虫荧光素酶活性进行归一化。
7.统计学方法：本研究中的数据来自至少3个独立的实验。应用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析。差异通过Student′st检验(两组数据)或单因素方差分析(3组数据)确定。以P<0.05为差异有统计学意义。
1.HOXA11-AS在肺鳞状细胞癌组织和细胞系中高表达：为了明确HOXA11-AS在肺鳞状细胞癌进展中的作用，笔者首先采用RT-qPCR方法检测了HOXA11-AS在肺鳞状细胞癌组织和配对的相邻正常组织，以及在肺鳞状细胞癌细胞系中的表达变化。结果显示，与相应的正常组织和正常细胞对照比较，HOXA11-AS在肺鳞状细胞癌组织和细胞中的表达更高(图1)。
图1 HOXA11-AS在肺鳞状细胞癌组织(A)和细胞系(B)中上调*P<0.01,**P<0.001
2.沉默HOXA11-AS抑制肺鳞状细胞癌进展：为了阐明HOXA11-AS是否参与了肺鳞状细胞癌的发生过程，笔者使用小干扰RNA(siRNA)来特异性敲低HOXA11-AS的表达。与si-NC组比较，si-HOXA11-AS组的肺鳞状细胞癌细胞中HOXA11-AS的表达显著降低(图2A)。此外，MTT实验发现，与转染si-NC的细胞比较，转染si-HOXA11-AS的细胞存活率明显降低(图2B)。Transwell实验结果也显示，敲低HOXA11-AS后，肿瘤细胞的浸润和迁移能力降低(图2C)。上述研究结果表明，HOXA11-AS的敲低在体外阻碍了肺鳞状细胞癌细胞的增殖。
图2 HOXA11-AS的沉默抑制了肺鳞状细胞癌的进展A.转染后48h，检测HOXA11-AS在细胞中的表达;B.MTT法分析转染后24、48和72h细胞的细胞活力;C.Transwell法分析转染后细胞的侵袭和迁移能力。*P<0.01，**P<0.001
3.HOXA11-AS通过ceRNA机制靶向调控miR-149-3p表达：现有研究表明，lncRNA可通过靶向结合minRNA来发挥其调控作用。在本研究中，笔者使用miRcode软件搜索了HOXA11-AS的下游miRNA，发现HOXA11-AS可以与miR-149-3p结合，HOXA11-AS与miR-149-3p之间的结合位点如图3A所示。与miR-NC比较，miR-149-3p mimics有效地提高了其在NCI-H520细胞中的表达(图3B)。随后的双荧光素酶报告基因检测进一步证实了HOXA11-AS和miR-149-3p之间的靶向关系，在细胞中，使用miR-149-3p mimics，导致HOXA11-AS WT的荧光素酶活性降低(图3C)，而HOXA11-AS MUT的荧光素酶活性未见明显变化(图3D)。其次，笔者分析了肺鳞状细胞癌组织和细胞系中的miR-149-3p水平，发现肺鳞状细胞癌中miR-149-3p表达明显降低(图3E)。然后，笔者探索了HOXA11-AS对miR-149-3p表达的影响，发现沉默HOXA11-AS可上调细胞中miR-149-3p的表达；
相比之下，HOXA11-AS的引入显著降低了miR-149-3p水平(图3F)。RT-qPCR检测显示，瞬时转染anti-miR-149-3p成功下调miR-149-3p表达(图3G)。如图3H所示，转染si-HOXA11-AS显著抑制了转染细胞的细胞活力，但同时引入anti-miR-149-3p几乎消除了抑制作用。此外，如图3中I和J所示，Transwell实验结果与MTT结果一致。综上所述，HOXA11-AS敲低可能通过增加miR-149-3p的表达而抑制肺鳞状细胞癌的增殖。
图3 HOXA11-AS直接与miR-149-3p相互作用A.miRcode预测的HOXA11-AS与miR-149-3p之间的潜在结合位点;B.通过RT-qPCR 检测miR-149-3p表达;C、D.转染了miR-149-3p或miR-NC的细胞在转染48h后进行WT-HOXA11-AS和MUT-HOXA11-AS荧光素酶活性的双荧光素酶报告基因检测;E.通过RT-qPCR检测肺鳞状细胞癌细胞正常细胞中的miR-149-3p水平;F.RT-qPCR检测转染对照(空白)、si-NC、si-HOXA11-AS、pcDNA或HOXA11-AS 的肺鳞状细胞癌细胞中miR-149-3p的表达;G.RT-qPCR检测miR-149-3p抑制剂的敲低水平;H.MTT法分析转染后24、48和72h癌细胞的细胞活力;I、J.Transwell检测细胞迁移和侵袭能力。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。所有实验都独立重复3次
4.SPT16是miR-149-3p的直接靶点，HOXA11-AS通过靶向沉默miR-149-3p而上调SPT16：此外，笔者还利用TargetScanHuman 7.2寻找miR-149-3p的下游基因，发现了miR-149-3p与SPT16之间的结合区域。miR-149-3p与SPT16 3′-UTR的关系如图4A所示。然后采用双荧光素酶报告基因试验验证miR-149-3p与SPT16的相互作用。miR-149-3p mimics的使用显著降低了NCI-H520细胞中WT-SPT16的荧光素酶活性，但对MUT-SPT16没有影响(图4中B和C)。随后，采用RT-qPCR检测SPT16在肺鳞状细胞癌细胞株中的mRNA表达水平，结果表明，与相应的对照比较，SPT16在肺鳞状细胞癌细胞株中呈高表达(图4D)。此外，实验进一步证明(图4E)，在细胞中，miR-149-3p过表达导致SPT16mRNA表达量明显减少，而当过表达HOXA11-AS后，SPT16mRNA表达量升高。因此，HOXA11-AS在肺鳞状细胞癌中通过靶向沉默miR-149-3p来介导SPT16表达。
图4 SPT16是miR-149-3p的直接靶点，HOXA11-AS通过靶向抑制miR-149-3p上调SPT16A.TargetScanHuman 7.2预测的miR-149-3p与SPT16之间的结合区域;B、C.双荧光素酶报告基因检测转染miR-149-3p或miR-NC细胞中WT-SPT16的荧光素酶活性;D. SPT16在肺鳞状细胞癌细胞系以及正常细胞的mRNA表达水平;E.检测转染对照(空白)、miR-NC、miR-149-3p、miR-149-3p + pcDNA或miR-149-3p+HOXA11-AS的SPT16mRNA水平。*P<0.01，**P<0.001。所有实验都独立重复3次
肺鳞状细胞癌是一种恶性程度较高并且存活率很低的肿瘤[17]。笔者观察到相比于正常肺组织和肺细胞系，HOXA11-AS在肺鳞状细胞癌组织和细胞系中的表达更高，敲低HOXA11-AS抑制了肺鳞状细胞癌细胞系的增殖和迁移能力。本研究进一步探索了HOXA11-AS、miR-149-3p和SPT16之间的靶向关系，得出HOXA11-AS直接靶向miR-149-3p, 而miR-149-3p可进一步调控SPT16而发挥作用。实验数据表明，HOXA11-AS可以通过靶向沉默miR-149-3p而介导SPT16表达，本研究显示，HOXA11-AS/miR- 149-3p/SPT16轴参与了肺鳞状细胞癌进展。
研究发现，HOXA11-AS可作为某些癌症病理过程中的诱导剂而发挥致癌作用。既往研究显示，HOXA11-AS在癌组织中高表达，而敲低HOXA11-AS可抑制肺鳞癌细胞的增殖能力。因此，笔者旨在研究HOXA11-AS在肺癌中发挥作用的具体分子机制。通过在线软件miRcode寻找到HOXA11-AS的靶向miRNA，并确定了miR-149-3p作为候选miRNA，随后通过双荧光素酶报告基因检测进一步验证。本研究数据显示，与正常组织和细胞系比较，miR-149-3p在肺鳞状细胞癌组织和细胞中明显下调。此外，miR-149-3p的敲低部分逆转了si-HOXA11-AS对肺鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用。
为明确miR-149-3p所作用的下游靶基因，笔者使用TargetScanHuman 7.2进行生物信息学分析，确定了SPT16为miR-149-3p的候选靶基因，随后通过双荧光素酶报告基因检测分析了两者的研究关系。结果显示，相比于正常组织和细胞系，SPT16的表达水平在肺鳞癌组织和细胞系中均显著上调。肺鳞癌中SPT16的表达与HOXA11-AS的表达呈正相关。在功能上，过表达SPT16明显逆转了si-HOXA11-AS所介导的对肺鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用。
综上所述，HOXA11-AS可通过与miR-149-3p结合促进miR-149-3p下游靶基因SPT16的表达，进而增强肺鳞癌细胞的增殖能力。本研究明确了HOXA11-AS/miR-149-3p/SPT16轴在肺鳞癌中的作用及调控机制，为研究HOXA11-AS在肺鳞癌及其他肿瘤疾病中的作用及机制提供了理论依据。HOXA11-AS/miR- 149-3p/SPT16轴有望成为肺鳞状细胞癌早期诊断和预后评估的分子标志物，针对HOXA11-AS/miR-149-3p/SPT16轴的靶向治疗可能成为缓解肺鳞状细胞癌等肿瘤的新手段。
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