李英 俞丽娟 李泽伦 公安部第一研究所
根据《检验检测机构资质认定管理办法》《检测和校准实验室认可准则》《司法鉴定/法庭科学机构能力认可准则》《公安机关DNA实验室等级评定办法》等文件法规要求，法庭科学实验室应定期对仪器设备进行保养、维护、校准。法医DNA实验室的核心仪器法医DNA遗传分析仪属于大型精密分析仪器，同样需要进行定期校准，只有保证仪器功能正常及各项技术指标符合规定方可开展相关的DNA鉴定工作。长期以来我国法医DNA实验室使用的遗传分析仪一直被国外公司垄断，国内也没有相应的校准规范，因此第三方计量校准机构无法对遗传分析仪进行校准，实验室人员由于缺乏对仪器原理和关键技术指标的深入了解也很难实施实验室内部校准，只能依靠国外生产厂家来完成校准工作。针对上述情况，2020年7月2日，国家市场监督管理总局发布了JJF 1838-2020《遗传分析仪校准规范》（以下简称《校准规范》）并于2021年1月2日实施[1]。
公安部第一研究所自2008年以来一直从事法医DNA遗传分析仪的研制工作，2014年研制成功我国首台GA118-16A型遗传分析仪，此后相继研制成功GA118-16B、GA118-24B等多款机型[2]并应用到200多家公安机关DNA实验室。在实战应用中，我们制定了GA118系列遗传分析仪的校准规范并一直在实验室认证认可中实施。本文根据首次发布实施的《校准规范》，结合GA118系列遗传分析仪的工作原理和关键技术参数，重新对GA118校准规范进行了修订，在满足《校准规范》的基础上结合仪器实战应用需求，研究探讨新的校准方法并在实践中得到成功应用。
GA118系列遗传分析仪基于毛细管电泳原理，如图1所示，通过在毛细管内部注入凝胶并在两端施加一定的高压，利用凝胶的筛分效应将标记有不同荧光染料长度不同的DNA片段进行电泳分离，在检测窗口处通过激光激发标记的荧光染料并对荧光信号进行采集，在面阵CCD内将荧光信号转换为电信号，得到DNA片段的染料波长、电泳速度、峰高等信息并生成原始数据文件。电泳完成后生成的原始数据文件，可用FastSTR 、GeneMapperTMID-X或GeneMarker 等二级分析软件进行分析。
GA118系列遗传分析仪在进行样本电泳前首先需要建立两个校正文件：空间校正和光谱校正。空间校正通过将各通道毛细管成像到面阵CCD上，建立空间位置对应关系，如图2所示；
光谱校正通过电泳带有不同荧光染料的荧光标准物，记录不同波长荧光染料分光到CCD上的区域并建立光谱校正矩阵（Matrix），用于对5色或6色荧光染料进行数据采集和光谱解耦，如图3所示。
数据分析时，分析软件首先根据设定的内标颜色、片段大小等信息识别内标峰并进行内标曲线拟合，一般提供多种拟合算法供用户选择，如图4所示。Allellic Ladder中包含有各个基因座目前已知的所有等位基因标准物，如基因座D8S1179中所有已知基因分型为5，6，7……19[3]，分别表示四碱基短串联重复序列[TCTA]连续重复的次数，分型6代表连续重复6次：[TCTA]6。软件根据每个Ladder 的峰值时间与内标标准曲线对比，计算出每个Ladder的片段长度并与给定值比较，长度误差在允许范围内为通过，所有Ladder通过后建立Ladder体系。样本同样与内标标准曲线对比得出片段长度，根据样本峰的颜色、长度与建立的Ladder体系比对，要求长度误差不超过±0.5bp，比对通过后标记出该样本的分型结果，不通过则标记错误原因。
（一）校准原则
本文制定的GA118系列遗传分析仪校准规范力求遵循校准项目科学合理、操作方法简单可行的原则，在包含《校准规范》中所有校准项目的同时，尽量保证规范的先进性与实用性，与实战应用需求和实验室具体情况相结合，参考的相关文献包括：
JJF 1838-2020《遗传分析仪校准规范》；
GB/T 37266-2018《法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》；
GA/T 1163-2014《人类DNA荧光标记STR分型结果的分析及应用》；
GA/T 383-2014《法庭科学DNA实验室检验规范》；
QZ/S 1504-2018《GA118-24B遗传分析仪》。
（二）校准参数
GA118系列遗传分析仪的校准参数包括：基线漂移和基线噪声、定性测量重复性、定量测量重复性、泳道差异、检测限、分辨力，其中分辨力是《校准规范》中没有要求的，是为了保证法医DNA实验室STR分型结果的正确性增加的校准参数，现就各校准参数说明如下：
（1）基线漂移和基线噪声：《校准规范》中明确了基线漂移和基线噪声的测量计算方法，GA118系列遗传分析仪是多毛细管通道、多荧光染料的毛细管电泳仪，在具体校准中，分别计算每根毛细管通道的不同荧光染料的基线漂移和基线噪声，以其最大值作为仪器的基线漂移和基线噪声，计算过程采用仪器配套的FastSTR 分析软件自动测量功能，可大幅度降低工作量，如图所示为蓝色荧光染料的基线噪声，最高噪声为67RFU。
（2）定性测量重复性：《校准规范》中以每根毛细管DNA标准物质（如：300bp片段DNA标准物质）的相对迁移时间相对标准偏差最大的作为仪器定性测量重复性，在实际操作中存在诸多不便，首先是迁移时间测量比较繁琐，分析软件没有直接给出迁移时间数值，需要人工查找；
其次如上述工作原理所示，电泳结果的定性依据是片段长度而非迁移时间，软件依据片段的迁移时间进行曲线拟合计算出片段长度，然后根据片段长度值进行分型，最终的输出结果是片段长度值和基因分型，迁移时间只是其中的一个过程值，因此GA118系列遗传分析仪的校准采用片段长度作为定型测量重复性参数。根据每个法医DNA实验室常用的检案试剂盒，如现在实验室常用的AB公司的ID Plus、VerifilerTMP lus，Promega公 司 的PowerPlex 21、Qiagen公司的Investigator 24plex等（采用的试剂盒均应通过GA认证），用试剂盒中的Ladder作为标准品，每个泳道连续电泳5次，选择试剂盒中最大长度Ladder，如VerifilerTMP lus中的Penta E基因座中的最后一个分型26作为定性测量重复性样本，数据分析时任选一个样本作为分析用Ladder，其余均作为样本进行分析，得出每次电泳后的片段长度值，以各泳道中该片段长度相对偏差最大值作为仪器定性测量重复性，如图7和表1所示。
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（3）定量测量重复性：同样取实验室常用试剂盒中最大长度Ladder的5次电泳峰面积计算相对偏差，以各泳道最大值作为仪器定量测量重复性。
（4）泳道差异：《校准规范》中泳道差异与定量测量重复性均采用标准片段的峰面积进行计算，但《校准规范》中计算公式表述不清晰，GA118系列遗传分析仪的校准采用如下公式计算泳道差异：
式中：
δ泳道差异——泳道差异；
Xi——第i个泳道的定量测量重复性；
——n个泳道的定性测量重复性平均值；
i——泳道序号；
n——泳道数。
同样取实验室常用试剂盒中最大长度Ladder的峰面积进行计算。
（5）检测限：以扩增试剂盒中的阳性对照作为样本，以PowerPlex 21试剂盒为例，阳性对照2800M的浓度为10ng/μl，扩增时进行稀释以保证加入到扩增体系中的DNA 含量为0.5ng，采用25μl扩增体系则其浓度为0.02ng/μl，配置上样缓冲液连续电泳三次，以基因座中最低的样本峰高按以下公式计算：
式中：
Di——第i个泳道的检测限；
HNi——第i个泳道的噪声峰高，RFU；
ρ ——样本浓度；
——第i个泳道的样本峰高平均值，RFU；
i——泳道序号。
取最大的Di作为仪器的检测限，合成相对不确定度和相对扩展不确定度按《校准规范》中给出的方法计算，样本浓度引入的不确定度按下式计算：
相对扩展不确定度计算：Ur=kucr(k=2)；
（6）分辨力：仪器的分辨力是指仪器对不同长度DNA片段的区分能力，在法医STR分型和测序应用中，要求仪器能够正确区分长度相差1bp的DNA片段，分辨力用如下公式计算：
式中：
Rs——分辨力；
P1——第1个峰的出峰时间（最大值），数据帧（pts）；
P2——第2个峰的出峰时间（最大值），数据帧（pts）；
W1——第1个峰的半峰宽；
数据帧（pts）；
W2——第2个峰的半峰宽，数据帧（pts）。
若相差1bp的两个片段按上述公式计算，Rs≤1表示仪器可以正确区分相差1bp的两个片段，两个片段长度最小只能相差1bp，分析软件如果能正确识别标准品中相差1bp的两个片段，表明仪器的分辨率达到了1bp的分辨力。由于半峰宽的测量十分困难和繁琐，在GA118系列遗传分析仪的校准中对于仪器分辨力的校准不进行具体计算，只给出是否满足1bp的结论，通过实验室常用试剂盒中Ladder的5次电泳结果，检查其中相差1bp的所有片段是否能被仪器正确识别，给出是否满足1bp分辨力的结论。
（三）校准项目及校准方法
Ga118系列遗传分析仪校准项目及方法如下：
（1）外观及功能检查：被检仪器外观应整齐、清洁，表面涂、镀层应无明显剥落、擦伤、露底及污垢；
所有紧固件不应松动，各种调节件应灵活、功能正常；
可拆部分应能无障碍拆装；
所有铭牌及标志应耐久和清晰。
（2）主要部件性能指标检查：自动进样器定位精度、激光器功率、电泳高压输出精度、恒温箱温控精度，按使用说明书要求进行。
（3）空间校正：按使用说明书要求进行。
（4）光谱校正：按使用说明书要求进行。
（5）仪器参数：采用实验室常用试剂盒配置校准用样本如下：一组空白样本，电泳一次用于校准基线漂移和基线噪声；
一组Ladder样本连续电泳5次用于校准定性测量重复性、定量测量重复性、泳道差异和分辨力；
一组扩增后的阳性对照样本连续电泳三次用于校准仪器检测限。
（6）数据记录及处理：实验结束后进行数据分析并按《校准规范》中参考格式进行原始数据记录，按上述校准参数中的计算方法得出校准结果并按表2所示记录结果。
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遗传分析仪作为法庭科学DNA实验室中的大型精密分析仪器，其检测结果主要应用于侦查破案和庭审证据，是目前进行个体识别和亲子鉴定最准确的技术手段，长期以来其计量校准一直缺乏统一的规范，此次《校准规范》的发布实施解决了该类型仪器计量校准的难题，为实验室的资质认定、能力认可提供了校准依据，推动了实验室管理的规范化、标准化。本文在《校准规范》的基础上，结合自研GA118系列遗传分析仪的工作原理和实验室实际应用需求，研究了科学规范、操作简单的校准方法，在实际应用中取得了良好的效果。
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