帅晋豪，王鹏，季昳驰
(眉山市人民医院 甲状腺乳腺外科,四川 眉山 621000)
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在全球发病率以每年3.1%的速度增长，从1980年的64.1万例增加到2010年的160万例[1]。世界卫生组织国际癌症研究机构发布2020年女性患乳腺癌约226万例，其中死亡人数达68万[2]。乳腺癌的治疗策略因分子亚型而异，目前已鉴定出LuminalA型、Luminal B型、HER2阳性型和三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)4种亚型。TNBC的特征是雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子 2-受体不表达，约占所有乳腺癌的15%～20%。与其他亚型的乳腺癌相比，TNBC更具侵袭性的生物学特性，转移较早、疾病进展迅速、对现有疗法的反应持续时间短，生存结果较差[3-4]。血清丝氨酸蛋白酶抑制剂A3(serum serpin A3，SERPINA3)是一种分泌型丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过蛋白水解抑制几种重要丝氨酸蛋白酶的生物活性，例如组织蛋白酶G和糜蛋白酶[4]，也是一种可被细胞因子刺激的急性期蛋白[5]。有报道显示，SERPINA3在实体瘤中表达增加[6]，其高表达被认为与结直肠癌[7]、肝细胞癌[8]和胶质母细胞瘤[9]的发生有关。Zhang等[10]研究表明SERPINA3的过表达促进TNBC肿瘤的迁移、侵袭和上皮间质转化，但目前还没有关于SERPINA3与TNBC临床病理参数相关性的数据，亦未见SERPINA3影响TNBC患者预后的独立危险因素的研究。本研究通过检测TNBC肿瘤组织和癌旁组织中SERPINA3的表达，分析其在TNBC组织中的表达水平与患者临床病理特征及预后的影响。
1.1 临床资料
选取2018年1月—2019年5月诊治的86例TNBC患者，按照SERPINA3在肿瘤组织中的表达情况将患者分为低表达组(免疫组化评分≤6分，n=35)和高表达组(免疫组化评分>6分，n=51)。纳入标准：初次确诊，术前未接受放化疗等治疗，行乳腺癌改良根治术。排除标准：合并其他肿瘤患者，预计生存时间小于3个月，术后未遵医嘱行规范的治疗。本研究经患者知情同意。收集患者的年龄、体质量指数(BMI)、绝经、空腹血糖、甘油三酯、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和血肌酐等一般资料。
1.2 方法
1.2.1病理资料 收集患者肿瘤组织学分级、组织病理学分类、术后肿瘤局部复发、肿瘤直径(≤2 cm、2～5 cm、≥5 cm)、区域淋巴结状态和远处脏器转移等病理资料。
1.2.2免疫组织化学检测标本 收集患者TNBC肿瘤组织及对应的癌旁组织，采用中性甲醛固定、石蜡包埋并制备石蜡切片(厚度约4 μm)。
1.2.3免疫组织化学检测组织中SERPINA3的表达 各组石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化及枸橼酸钠液抗原修复一抗SERPINA3(1 ∶200)，4 ℃孵育过夜，二抗(1 ∶400)室温孵育30 min。DAB试剂染色3～5 min、复染1～3min、返蓝1 min、中性树胶封2，显微镜下每张切片随机选取4个高倍镜观察定位。细胞核呈现棕黄色细颗粒状物质沉积，即为SERPINA3的阳性表达。由两位病理科医生在双盲的情况下独立阅片，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×200)，染色强度评分标准：无着色、浅黄色、棕黄色和棕褐色分别为0分、1分、2分和3分。阳性细胞比例评分标准：阳性细胞比例0、<25%、25%～<50%和≥50%分别为0分、1分、2分和3分，SERPINA3的染色强度评分×阳性细胞比例评分≤6分为低表达组(n=35)，SERPINA3的染色强度评分×阳性细胞比例评分>6分为高表达组(n=51)。
1.2.4随访 术后门诊定期随访，随访项目主要包括临床体检、乳腺彩超、乳腺X线、胸片或胸部CT、腹部超声、骨扫描(腋窝淋巴结转移>4枚等高危因素的患者)、血常规、血生化、乳腺肿瘤标志物、心肌标志物及治疗的依从性，评估患者手术、化疗和放疗的不良反应及是否有伴随疾病的发生。随访时间6～36个月，随访时间结束或患者死亡为随访终点。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0软件分析。计数资料以[n(%)]表示，行χ2检验。应用Kaplan- Meier分析法绘制SERPINA3高表达组和SERPINA3低表达组间生存曲线图，并采用Log- rank检验比较两组间的生存率。Cox单因素和多因素回归分析影响患者无进展生存期和总生存期的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 一般资料
两组TNBC患者年龄、BMI、绝经、空腹血糖、甘油三酯、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和血肌酐比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 两组TNBC患者一般资料比较Tab.1 Comparison of general data between both groups
2.2 SERPINA3在TNBC组织中的表达
SERPINA3在TNBC癌旁组织中的阳性表达率为5.8%(5/86)，在TNBC癌组织中的阳性表达率为100.0%(86/86)，差异有统计学意义(P<0.001)。见图1。
癌旁组织 癌组织图1 SERPINA3在癌旁组织和癌组织中的表达(SP，×200)Fig.1 Expression of SERPINA3 in para-cancerous tissue and cancer tissue (SP,×200)
2.3 SERPINA3表达水平与TNBC患者临床病理参数
SERPINA3高表达组患者肿瘤病理分级为Ⅱ级和Ⅲ级患者比例均高于SERPINA3低表达组，SERPINA3高表达组术后肿瘤局部复发患者比例高于SERPINA3低表达组，SERPINA3高表达组肿瘤直径>5 cm患者比例高于SERPINA3低表达组，SERPINA3高表达组区域淋巴结阳性患者比例高于SERPINA3低表达组，SERPINA3高表达组远处脏器转移患者比例高于SERPINA3低表达组。差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 SERPINA3表达水平对TNBC患者临床病理参数的影响[n(%)]Tab.2 Expression of SERPINA3 and its influence on clinic-pathological parameters in TNBC patients[n(%)]
2.4 SERPINA3表达水平与TNBC患者术后3年总生存率和无进展生存率
根据随访结果计算患者的3年总生存率，SERPINA3高表达组患者术后3年生存率为58.8%，SERPINA3低表达组术后3年总生存率为82.9%，log-rank检验显示SERPINA3高表达组术后3年总生存率低于SERPINA3低表达组(log-rankχ2=5.706，P=0.017)。SERPINA3高表达组患者术后3年无进展生存率为43.1%，SERPINA3低表达组术后3年无进展生存率为71.4%，log-rank检验显示SERPINA3高表达组患者术后3年无进展生存率低于SERPINA3低表达组(log-rankχ2=6.672，P=0.010)。见图2。
图2 SERPINA3表达水平对TNBC患者术后3年总生存率和无进展生存率的影响Fig.2 Effects of SERPINA3 expression on postoperative 3-year overall survival rate and progression-free survival rate in TNBC patients
2.5 影响TNBC患者总生存期的单因素和多因素COX回归分析
经COX单因素回归分析显示，肿瘤组织学分级、术后肿瘤局部复发、肿瘤大小、区域淋巴结转移、远处脏器转移及SERPINA3高表达是影响TNBC患者无进展生存期的因素；
将以上因素带入多因素COX回归模型中分析显示，肿瘤组织学分级Ⅲ级、术后肿瘤局部复发、肿瘤直径≥5 cm、区域淋巴结转移、远处脏器转移及SERPINA3高表达是影响总生存期的危险因素。见表3。
表3 影响TNBC患者总生存期的单因素和多因素COX回归分析Tab.3 Uni-variate and multi-variate COX regression analysis of factors affecting overall survival in TNBC patients
2.6 影响TNBC患者无进展生存期的单因素和多因素COX回归分析
经COX单因素回归分析显示，肿瘤组织学分级、术后肿瘤局部复发、肿瘤直径、区域淋巴结转移、远处脏器转移和SERPINA3高表达为影响无进展生存期的因素，将以上因素带入多因素COX回归模型中分析显示术后肿瘤局部复发、区域淋巴结转移、远处脏器转移和SERPINA3高表达为影响无进展生存期的危险因素。见表4。
表4 影响TNBC患者无进展生存期的单因素及多因素COX回归分析Tab.4 Uni-variate and multi-variate COX regression analysis of factors affecting progression-free survival
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其中TNBC约占乳腺癌的15%，流行病学数据显示TNBC发病年龄较轻，肿瘤侵袭性强，易于局部复发和转移[10]。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC患者的生存时间较短，5年内死亡率为40%[11]。TNBC具有高度侵袭性，约46%的患者会发生远处转移，转移后中位生存时间仅为13.3个月，术后复发率高达25%[12]。值得注意的是，TNBC患者恶性程度高、预后差、治疗靶点有限，因此寻找TNBC患者新的治疗靶点具有重要的临床价值。SERPINA3也称为α-1-抗糜蛋白酶，是一种分子量为55～66 kDa的分泌型丝氨酸蛋白酶，可抑制几种丝氨酸蛋白酶的活性[13]。以往研究表明，SERPINA3在胞质分裂、增殖、凋亡和肿瘤转移中发挥重要作用[14-15]。此外，还有报道显示SERPINA3参与多种免疫反应，有望成为子宫内膜癌的潜在免疫治疗靶点[16-17]。Nimbalkar等[18]人发现SERPINA3有助于胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间质表型的转变。此外，Luo等[19]人通过实时聚合酶链反应证明，高水平的 SERPINA3 信使 RNA与胶质瘤患者的不良预后相关。以上研究均显示SERPINA3参与恶性肿瘤的发展，可能子宫内膜癌和胶质瘤患者的预后，但对TNBC患者的影响还不明确。
在本研究通过免疫组化检测到TNBC组织中SERPINA3阳性表达率高于癌旁组织，推测SERPINA3可能参与TNBC的恶性进展。通过分析TNBC组织中SERPINA3表达与TNBC病理特征的关系，结果表明SERPINA3高表达促进TNBC向高级别肿瘤组织学分型进展，促进TNBC肿瘤的增长、侵袭、远处转移及术后的复发。Yuan等[17]研究显示，SERPINA3高表达与胶质瘤恶性肿瘤相关，包括高级别的肿瘤和较短的生存时间。Zhang等[10]研究显示，SERPINA3可以调节TNBC细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化，其阳性表达增加TNBC细胞对顺铂的耐药性，因此SERPINA3可能成为治疗TNBC的有效靶点。Zhang等[10]研究进一步证实了SERPINA3与TNBC的恶性侵袭相关。生存分析结果显示，SERPINA3高表达组TNBC患者的3年总生存率和无进展生存率均低于SERPINA3低表达组，说明SERPINA3影响TNBC患者的预后。为了更进一步了解SERPINA3是否为TNBC预后不良的危险因素，Cox单因素和多因素回归分析显示SERPINA3高表达为TNBC 患者3年总生存率和无进展生存率的危险因素。Cao等[20]研究显示高表达的SERPINA3与结肠癌的主要临床病理特征密切相关，且沉默SERPINA3的表达可显著抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭，为治疗结肠癌细胞肝转移提供了一种有前景的治疗策略。根据Zhang等[10]和Cao等[20]研究思路设想，沉默SERPINA3亦有望成为治疗TNBC患者的有效靶点。
本研究仅分析TNBC组织中SERPINA3的表达与患者临床病理特征和预后的影响，但具体的作用机制并不明确。King等[21]研究表明，SERPINA3也是一种受细胞因子调节的炎症蛋白，对许多细胞因子非常重要，包括白细胞介素6和白细胞介素1，细胞因子失衡会导致免疫系统的高激活或低激活，导致自身免疫性疾病或免疫抑制，有利于感染和肿瘤生长。以上可能是SERPINA3表达水平增加促进肿瘤进展的作用机制，但仍需更进一步的探索，为SERPINA3在TNBC患者中靶向治疗提供充分的理论依据。
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