[摘要] 目的 研究内皮细胞型一氧化氮合成酶（eNOS）Glu298Asp基因多态性与牙周炎伴Ⅱ型糖尿病易感性的关 系。方法 收集慢性牙周炎患者、慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病患者、Ⅱ型糖尿病患者和牙周健康者的颊黏膜拭子，提取DNA后应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测eNOS Glu298Asp的基因型分布。结果 慢性牙周炎组、Ⅱ型糖尿病组、慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病组、正常组eNOS Glu298Asp基因型的分布差异有统计学意义（??2=18.503，P=0.005），等位基因频率分布差异也有统计学意义（??2=8.243，P=0.041）。慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病组与正常组相
比，T基因型的OR值为0.962，95%可信区间为0.737～1.256，说明T基因型可能为糖尿病和牙周炎的保护因素；G基因型的OR值为1.043，95%可信区间为0.781～1.391，说明G基因型可能为二者的危险因素，但差异无统计学意义。结论 慢性牙周炎、慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病、糖尿病的易感性可能与eNOS Glu298Asp多态性有关。
[关键词] 慢性牙周炎； Ⅱ型糖尿病； 一氧化氮合成酶； 基因多态性
[中图分类号] Q 786 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.016
慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）和Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）有双向联系[1]。1999年世界牙周病学研讨会对牙周病进行重新分类，将伴发糖尿病的牙周疾病单独命名，显示了牙周病学界对糖尿病和牙周病关联性的重视[2]。
一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）是一氧化氮合成过程中的关键酶。NOS可分为内皮细胞型NOS（endothelial NOS，eNOS）、神经型NOS（neural
NOS，nNOS）和诱导型NOS（inducible NOS，iNOS）。eNOS主要存在于内皮细胞、血小板、中枢和外周神经细胞中，依赖于钙离子或者钙离子调节蛋白激活，起着维持细胞信号传递、调节血管紧张素及神经传递等重要生理功能。eNOS Glu298Asp基因多态性与牙周炎的炎症程度有关。Kendall等[3]研究发现CP患
者eNOS 298T等位基因明显高于正常对照组。研究发现：eNOS Glu298Asp基因多态性与Ⅱ型糖尿病[4]、Ⅱ型糖尿病患者的心血管疾病易感性相关[5]，也可
作为糖尿病肾病的遗传标志[6]。
牙周炎与系统性疾病关系的研究是牙周病学研究的热点之一，通过该研究期待对牙周炎有更进一步的认识，为其诊断和治疗提供依据[7-9]。现阶段对于eNOS与口腔疾病的研究甚少，国内外尚未见eNOS Glu298Asp基因多态性与糖尿病伴牙周炎关系的研究报道。本文旨在研究eNOS Glu298Asp基因多态性与糖尿病伴牙周炎易感性的关系，为进一步探讨eNOS在牙周炎和Ⅱ型糖尿病中的相关作用和意义提供依据。
1 材料和方法
1.1 研究对象
本试验选取2009年3月—2010年12月在四川大学华西医院内分泌科和体检中心以及四川大学华西口腔医院牙周科就诊的汉族患者200例为研究对象，包括CP患者、CP伴T2DM患者、T2DM患者和牙周健康者。其中CP组男性25人，女性25人，年龄30～60岁，平均年龄为（45±4.6）岁；CP+T2DM组男性28人，
女性22人，年龄31～64岁，平均年龄为（43±3.8）岁；
T2DM组男性28人，女性22人，年龄31～64岁，平均年龄为（44±4.2）岁；正常组（H组）男性24人，女性26人，年龄30～63岁，平均年龄为（46±3.5）岁。CP患者
的纳入标准：1）全口至少有10颗可进行牙周评价的牙齿，至少有4颗磨牙（不包括第三磨牙）；2）至少有3个象限内有1个或多个位点探诊深度（probing depth，
PD）≥6 mm、附着丧失（attachment loss，AL）≥5 mm；3）X线片显示牙槽骨吸收≥1/3[10]。凡符合CP诊断标准的汉族患者均纳入为CP组。所选牙周炎患者均无糖尿病、心血管疾病和内分泌等系统性疾病。T2DM诊断标准按世界卫生组织1999年公布的糖尿病诊断值：空腹血糖浓度≥7.0 mmol·L-1，餐后2 h血糖浓度≥11.1 mmol·L-1，葡萄糖耐量试验中2 h血浆葡萄糖水平≥11.1 mmol·L-1，有显著的胰岛素抵抗为主伴有胰岛素相对不足，或有胰岛素分泌不足为主伴有或不伴有胰岛素抵抗所致的糖尿病；无其他系统性疾病的汉族患者纳入。符合CP诊断标准又符合诊断标准的汉族患者纳入CP+T2DM组。正常组参照Armitage等[10]的标准，要求牙周健康/龈炎，即口腔卫生情况良好，平均临床牙周附着丧失（clinical attachment loss，CAL）≤0.5 mm，邻面没有CAL≥3 mm的位点，失牙数≤2（系指除第三磨牙或正畸需要拔牙、外伤或者重度龋失牙及先天性缺牙外的失牙数），X线片显示无牙槽骨吸收，全身健康，无系统性疾病。以上各组要求：1）年龄30～65岁，按性别、年龄配对；2）试验前1个月内未服用过抗生素；3）试验前6个月内未行牙周治疗；4）无妊娠妇女；5）无吸烟（不吸烟或者戒
烟10年以上者）和饮酒等不良嗜好。所有研究对象均知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 样本收集和DNA提取 用无菌棉签取患者双侧颊黏膜拭子，室温下自然干燥过夜，无菌密闭容器中保存。取颊黏膜拭子，剥取拭子表层加入1 000 μL无菌水的试管内，旋转拧干拿出，12 000 r·min-1离心
5 min，弃上清液。加入5%Chelex-100液200 μL使其浸没标本，再加入蛋白酶K（20 mg·mL-1）10 μL漩涡 振荡混匀，55 ℃水浴3 h，煮沸8 min，-20 ℃保存。
1.2.2 eNOS Glu298Asp多态性目的基因的扩增和酶切 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）检测eNOS Glu298Asp的基因多态性。
引物（大连宝生物工程有限公司）序列为：上游引物5’-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3’，下游引物5’-CCCAGTCAATCCTTTGGTGCTCA-3’。PCR反应体系（25 μL）：DNA模板6 μL，2×Taq PCR Master-Mix 12.5 μL，上下游引物各1.25 μL，dd H2O 4 μL。吹打后轻弹管壁混匀，1 000 r·min-1瞬时离心。
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）循环参数：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析证实PCR扩增成功，取纯化后的PCR产物，限制性内切酶Ban Ⅱ（成都宝信生物技术有限公司，目录号N1215006）酶切，恒温水浴箱37 ℃水浴过夜。酶切片段经2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后通过UV凝胶成像系统判定结果。
1.3 PCR质量控制措施
在盲法下测定所有标本，在单盲情况下随机抽取10%样本重复测定各位点基因型，以确保所测基因型的可靠性和重复性。
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件包对实验数据进行分析，计数资料以率表示，根据Hardy-Weinberg平衡估计等位基因频率，4组间基因型分布及等位基因频率的比较采用行×列表??2检验，并计算比值比（OR）和95%可信区间（CI）。
2 结果
2.1 eNOS Glu298Asp多态性目的基因的扩增和酶切
分析
目的基因扩增片段长度为457 bp。根据限制性内切酶Ban Ⅱ酶切结果，GT型者（457、320、137 bp）为3条电泳带；GG型者（320、137 bp）为2条电泳带；TT型者（457 bp）为1条电泳带。
本试验中共有GG型43例，其中CP组19例，T2DM组2例，CP+T2DM组10例，H组12例；GT型110例，其中CP组22例，T2DM组36例，CP+T2DM组27例，H组25例；TT型47例，其中CP组9例，T2DM组12例，CP+T2DM组13例，H组13例。4组基因型的分布差异有统计学意义（??2=18.503，P=0.005）；等位基因频率分布差异有统计学意义（??2=8.243，P=0.041），具体
见表1。
2.2 危险因素评估
2.2.1 CP+T2DM组与H组相比 CP+T2DM组与H组相比，T基因型的OR值为0.962，95%可信区间为0.737～1.256，说明T基因型可能为糖尿病和牙周炎的保护
因素，但差异无统计学意义。G基因型的OR值为1.043，95%可信区间为0.781～1.391，说明G基因型可能为糖尿病和牙周炎的危险因素，但差异无统计学意义。
2.2.2 T2DM组与H组相比 T2DM组与H组相比，T基因型的OR值为0.850，95%可信区间为0.662～1.091，说明T基因型可能为糖尿病的保护因素，但差异无统计学意义。G基因型的OR值为1.225，95%可信区间为0.896～1.674，说明G基因型可能为糖尿病的危险因素，但差异无统计学意义。
2.2.3 CP组与H组相比 CP组与H组相比，T基因型的OR值为1.275，95%可信区间为0.938～1.734，说明T基因型可能为牙周炎的危险因素，但差异无统计学意义。G基因型的OR值为0.817，95%可信区间为0.632～1.055，说明G基因型可能为牙周炎的保护因素，但差异无统计学意义。
3 讨论
人类编码eNOS基因位于染色体7q35～36，包含 26个外显子和25个内含子，染色体全长21 kb，编码含有1 203个氨基酸的蛋白质。目前发现eNOS主要的基因变异为第7外显子处G894→T突变，导致其编码的第298位氨基酸由谷氨酸（Glu）变成天冬氨酸（Asp），该变异与牙周炎及系统性疾病有关[11]。
本试验总体结果显示基因型GT>TT>GG，各基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，4组eNOS Glu298Asp基因型的分布差异有统计学意义（??2=18.503，P=0.005）。等位基因频率分布差
异也有统计学意义（??2=8.243，P=0.041）。本实验数据显示T基因型可能是CP候选基因型，然而目前的研究尚未证明T基因型导致牙周炎的机制。T基因型可能与eNOS其他功能相关基因连锁不平衡[12]，T基因可能是疾病连锁易感基因，从而使病例组与对照组间产生假阳性。
有文献报道：eNOS Glu298Asp的TT基因型占普通人群9%～13%[13]，而本实验TT基因型占18%～26%，这可能与种族不同有关。Glu298Asp多态性是eNOS基因多态性中唯一编码区基因突变且无沉默区突变。该基因突变与eNOS蛋白质、NO合成、内皮功能有重要关系，这可能暗示TT基因型可能导致内皮功能障碍，合成低水平NO[14-16]。eNOS Glu298Asp基因多态
性与糖尿病及牙周炎有关，致病机制可能为局部细胞因子过多，C反应蛋白、纤维蛋白原、白细胞数增加引起系统炎症反应[6]。
笔者初步研究发现eNOS Glu298Asp基因多态性与CP以及CP伴T2DM相关。eNOS Glu298Asp的突变对CP、CP伴T2DM及糖尿病易感性的研究还需扩大样本进一步的研究。它与T2DM、CP等疾病关系密切而且复杂，在发展过程中的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。 [参考文献]
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（本文编辑 杜冰）