摘 要：分光光度计是制药厂、化工厂、研究所使用最普遍的分析仪器之一，在分光光度计的使用及检定中，它的准确程度直接关系到所测数据的可信性及科学性。所以提高检定准确度显得尤为重要。本文针对分光光度计的检定与使用应注意的事项进行了阐述。
关键词：分光光度计；检定；波长；注意事项
中图分类号：TH74 文献标识码：A
1可见分光光度计的原理
可见分光光度计是一种结构简洁、使用方便的单光束分光光度计，基于样品对单色光的选择吸收特性可用于对样品进行定性和定量分析。其原理是：当一束单色光照射待测物质的溶液时，当某一定频率(或波长)的可见光所具有的能量(hf)恰好与待测物质分子中的价电子的能级差相适应(即ΔE=E2-E1=hf)时，待测物将对该频率(波长)的可见光产生选择性的吸收。用可见分光光度计可以测量和记录其吸收程度(吸光度)。由于在一定条件下，吸光度A与待测物质的浓度C及吸收地长度l的乘积成正比，即A＝ KCL，所以，在测得吸光度 A后，可采用标准曲线法、比较法以及标准加入法等方法进行定量分析。
2 检定前对仪器波长进行粗略检查
可见分光光度计的波长准确度是很重要的；特别在比较仪器时，波长准确度显得更加重要。因为物质对不同波长的光吸收时，有不同的摩尔吸光系数。我们知道，分光光度计分析测量的原理是基于郎伯- 比尔定律，其数学表达式为：
A=- lg（I/I0）=- lgT=klc
其中：
A- 物质的吸光度
I0- 入射的单色光强度、
I- 透射的单色光强度
T- 物质的透射比
k- 物质的吸光系数
l- 被分析物质的光程
c- 物质浓度
郎伯- 比尔定律适用的前提条件是单色光，从公式中可以看出如果光的波长发生变化，将直接影响吸光度及物质浓度的测量结果，由此可见光的波长示值误差在分光光度计检定与使用中的重要性。针对某些厂矿企业实验室环境条件差，磁场、震动、腐蚀性气体对仪器的影响且使用比较频繁，容易造成仪器出现故障的情况，为了提高工作质量和效率，在检定前，应首先粗略检查仪器的光路，如果没有大的问题，可进一步按规程进行检定，如果不符合要求，应先粗略调整光路后再进行检定，这样可提高工作效率，收到事半功倍的效果，具体的方法是：
将仪器波长置于580nm 处，狭缝置于2 nm处（如果是可见分光光度没有必要），打开试样室盖，用一张白纸插入参比光路或样品的光路中央，这时在白纸上应看到一个清晰明亮完整的长方形橙黄色光斑。在紫外区一样，应看到一个亮度稍暗的长方形橙黄色光斑，当手动波长向长波方面变动时，应看到光斑的颜色由黄变红，继之当手调波长向短波方面时，应看到光斑颜色由红变黄向紫色变化。如果仪器波长检测能如上所述顺利完成，则说明仪器光路基本正常，波长示值误差应在2nm 范围以内。
3 仪器波长调整后，要通知该仪器操作人员
在定量分析中，虽然出现了许多功能先进的分光光度计，但在企业的一线分析中，更多的仍是采用标准曲线法，它是基于求得一组标准溶液所对应的吸光度与被测样品的吸光度进行比较，而得到被测物质含量的一种方法，也是分光光度法定量分析中最经典的方法，它的理论依据仍是郎伯-比尔定律。在检定中，如果发现仪器波长示值超差，需要调整，在调整波长后，检定人员如果没有及时告知对方，对方可能仍使用以前的标准曲线，就会造成检测结果严重偏离。可见一定要及时告诉该仪器操作人员或质管人员，波长调整后应重新绘制标准曲线才能进行下一次检测，否则检测结果将会出现较大偏差或失误。因为原标准曲线是在波长调整前绘制的，现在波长调整后，与原来相比吸光度将随之发生变化，可见检测结果不单纯与仪器有关，与标准溶液的选择、配制、称量以及如何正确使用仪器等方面都有关系。
4 要重视对比色皿成套性的检定
在分光光度计的检定中，我们往往重视对仪器本身的检定，而容易忽视对仪器配套使用的比色皿成套性的检定，这也是造成仪器分析结果偏离或超差的一个重要因素。很多企业操作人员由于对仪器结构及分析原理了解不够，也容易忽视这一问题，从公式中不难看出，如果比色皿杯子的尺寸以及透光性发生变化，将直接影响检测结果的准确性。在检定中，有时会遇到企业反映检测结果有问题，怀疑是仪器波长超差，但到现场经我们认真反复对仪器进行检定后，发现仪器各项技术指标没有大的问题，基本符合规程的要求，再检查溶液的配制，也没有发现较大的问题，最后发现配套使用的两个比色皿杯，从外观上看颜色深浅不一致，经检定后发现两个比色皿示值误差在10%左右，严重超差。经询问得知，造成这两个杯子颜色不一致的原因是：企业操作人员习惯做法是盛放参比溶液与盛放样品溶液的比色皿长期固定不变且不注意及时清洗，因而造成盛放样品溶液的比色皿杯由于污染程度相对严重而使比色皿表面颜色变深，久而久之，两个比色皿透射比出现较大的误差。针对这一情况，我们告诉企业操作人员，配套使用盛参比液比色皿与盛样品溶液的比色皿杯不是固定不变的，可以互换使用，但必须保持清洁，用完后应及时用蒸馏水作参比检查其成套性，其误差不应超过0.5%，这一点在规程上是有明确规定的。另外，比色皿透光面如遭到污染，应使用蒸馏水缓缓冲洗，然后再用洁净而干燥的细布或专用镜头纸轻轻擦净，最好不要用毛刷或滤纸等硬性物质擦拭，以免出现划痕，造成比色皿报废，使用完毕后，一定要及时给予清洗。清洗时，可用微量浓度的酸或一定浓度有机溶剂浸泡清洗，然后用蒸馏水冲洗，最后应在干净的环境中风干，切勿用热风烘烤吹干，以免使吸收池形状、尺寸发生微小变化，因而影响光程直至检测结果。
5 检定用计量标准争取得到更多的的信息，以便灵活使用
我们在检定中发现，制药行业使用紫外分光光度计较多，且大多数是进口仪器，自动化程度高，企业经常会根据检品的需要和《药典》的规定，往往对仪器设定好使用条件，让操作人员按部就班地操作，不允许随意改变设定条件，以免仪器出现故障影响生产，这对企业管理来说是一件好事，但有时会给我们检定工作带来一定的困难，如何在这种情况下进行检定工作，就需要我们灵活地使用检定规程。比如，大多数药厂使用紫外分光光度计，参考结果经常是吸光度值而不是透射比值，而我们的规程和检定证书按常规给出的值却是透射比值，这就为工作带来不便。虽然二者之间可以互相换算，但在现场检定中，为了更快、更便捷地了解仪器，我们的计量标准在上级部门检定时，如果能在给出透射比标准值的同时再给出吸光度标准值更好。近年来，我们通过和上级检定部门沟通，吸光度和透射比这两个标准值同时给出，方便了现场工作。
6 波长检定时应注意事项
在波长检定时，对于非自动扫描仪器如721 型、722 型、751 型、752 型等仪器，检定规程仅说明在波长检定点附近单向逐点测出标准物质的透射比或吸光度，而没有明确说明检定时波长是从低到高进行还是从高到低进行为好。事实上二者均可以实施，但在具体操作时是不同的。对于从事检定工作时间不长的检定员来说，后者操作有可能造成仪器光源或光电接收系统故障。所以，一般情况下，我们尽量选择从低波长点向高波长点逐渐进行，这样光源强度是由弱到强、由小到大成渐进变化，对仪器光电接收系统起到有益的保护作用，而不是由强到弱或由弱到强突变刺激仪器，以免对仪器光源和光电接收系统造成意外故障，给检定工作带来不便。
7 更换光源时应注意事项
对于721 型可见分光光度计, 钨灯更换时除要仔细检查电源线和钨灯头焊点是否接触良好, 还要注意灯丝竖线要垂直正确对准椭圆形光窗,然后调整波长至580nm，再调整灯架上的螺钉上下、前后、左右，直至能在比色皿槽看到方正明亮的橘黄色光斑。对于插拔件灯泡来说，例如722 型、723 型、752 型等相对容易，一般情况仅需要调整灯的上下位置，使580nm 时长方形黄色光斑中心照在入射狭缝上即可。在更换氘灯时波长仍调在580nm，狭缝调至最大，调整氘灯位置应能在狭缝上看到微弱且完整的长方形橘黄色光斑，但应注意在更换氘灯时最好戴上防紫外线眼镜，以免长时间工作眼睛被灼伤。如果没有防护眼镜，要快速、短时间看准位置调整、或稍停片刻让眼睛休息后再调整。
结束语
综上所述，分光光度计属于实验室计量仪器的一种，按国家标准必须定期检定，进行量值溯源。只有熟练地操作仪器，定期检定，才能确保仪器波长的精确度，从而才能保证测定的准确性，同时还能及时发现仪器存在的问题。
参考文献
[1]吴文铭，紫外可见分光光度计的及其应用[J].生命科学仪器，2009.07.
[2]袁波，赵海鹰，窦晓鸣.紫外可见分光光度计的发展与现状[J].现代科学仪器，2004.03.