摘要:目的:建立北虫草提取物中多糖的含量测定方法。方法:采用将多糖水解成单糖,经与显色剂3,5-二硝基水杨酸试液显色后,在520nm处测定吸收度的分光光度法。结果:虫草多糖在0.0006mg～0.030mg范围内时与吸收值有良好的线性关系,R=0.9992,平均加样回收率为99.54%,回收率的RDS为0.63%（n=11）。结论:该方法操作简便、灵敏、准确、重现性好,适用于虫草多糖的质量控制。
目前国内的北虫草人工养殖规模不断加大,北虫草子实体及北虫草培养基中含有多种生理活性物质,其中的虫草多糖是含量最高的,可以占到总干重量的3%～8%[1],虫草多糖具有提高免疫功能、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、抗放射、保护肾脏、抗病毒、降血脂、抗动脉粥样硬化、保肝、耐缺氧等作用[2] [3]。北虫草提取物是以人工栽培的北虫草子实体及北虫草培养基为原料,经水提－醇沉工艺生产所得,为有效控制北虫草提取物的质量,采用分光光度法对北虫草提取物中多糖的含量进行了测定。
关键词:分光光度法 北虫草提取物 虫草多糖 含量测定
1、仪器与试剂
北虫草提取物（黑龙江新医圣制药有限责任公司）;UV754N型可见—紫外分光光度计（上海精密科学仪器）;葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所,批号:110833-200902）;试剂均为分析纯,水为重蒸馏水。
2、方法
2.1 单糖供试品溶液的制备
取本品,研细,精密称取0.8g,置研钵中,加少量水研磨片刻,并用水分次转移至100ml 量瓶中,加水至刻度,摇匀,离心,取上清液,即得。
2.2 总糖供试品溶液的制备
取本品,研细,精密称取0.8g置研钵中,加少量水研磨片刻,用盐酸溶液（1→2）10ml分次将糊状物转移至烧瓶中,加热回流30分钟,放冷,加40%氢氧化钠溶液调节PH值至中性,移入500ml瓶中,加水至刻度,离心,取上清液,即得。
2.3 北虫草多糖含量的测定
精密量取对照品溶液与单糖、总糖供试品溶液各1ml,分别置25ml量瓶中,各加3,5-二硝基水杨酸试液2ml,摇匀,置沸水浴中加热5分钟,立即冷却。加水至刻度,取水1ml,同法制成空白溶液,作空白,照分光光度法（中国药典2010版一部附录VA）,分别在520nm波长处测定吸收度,按公式计算虫草多糖的含量,即得。
公式:
式中:C样:供试品的浓度;C对:对照品溶液浓度; A对:对照品溶液吸收度;A总:总糖供试品溶液吸收度;A单:单糖供试品溶液的吸收度;W总:总糖测定取样量W单:单糖测定取样量。
3、结果与分析
3.1 线性相关性实验
分别精密量取对照品溶液（浓度0.03mg/ml）0.1ml、0.5ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml置50ml容量瓶中,加1.5ml的3,5-二硝基水杨酸试液,混匀,置水浴中加热5分钟,迅速冷却,加水至刻度,摇匀,照分光光度法,在520nm的波长处分别测定吸收度（见表1）,以吸收度A为纵坐标,对照品浓度为横坐标绘制标准曲线（见图1）,计算。
回归方程为:Y＝0.0496X+ 17.3021 R＝0.9992
线性范围0.0006mg～0.030mg,相关性良好。
3.2 测定波长选择与稳定性实验
用3,5-二硝基水杨酸测定多糖中还原糖时,在475-486nm及520nm处有两个最大吸收波长[4]。本试验样品加显色剂后放置不同的时间分别在486nm及520nm处测定总糖的A值,比较其稳定性,结果见下表2:
3.3 样品水解时间的考查
取本品三份,每份0.8g,精密称定,置研钵中,加少量水研磨片刻,用盐酸溶液（1→2）10ml分次将糊状物转移至烧瓶中,分别加热回流10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟,含量结果见下表3。
3.4 精密度实验
分别取总糖、单糖供试品溶液（批号:20100801）,连续取样分别测定6次,记录吸收度如下表4。
3.5 重复性试验
取本品6份（批号:20100801）,依试验方法测定含量结果见表5。
3.6 回收率试验
采取加样回收试验法,取本品6份,每份0.75g,精密称定（总糖含量:31.5%）,依试验方法制备供试品溶液,直至水解完成,用40%氢氧化钠中和,在总糖供试液中精密加入葡萄糖对照品溶液1.0ml(0.3mg/ml),进行含量测定,计算回收率见表6。
加样回收率（%）=×100%
4、讨论
(1)北虫草提取物取样后应及时测定含量,不能马上分析时,应放入冰箱保存,否则,由于多糖变质,使分析结果偏低;分析样品时的稀释样,不能放久,由于容量瓶对糖有吸附,会造成糖含量偏低。
(2)实验表明盐酸的用量、浓度、显色液的用量及配制时间、显色温度及时间等因数对吸光度值均有不同程度的影响。
(3)色素等还原性物质可与显色剂显色,可采用水解前测定值校正水解后测定值的方法,简便而有效地排除了色素等杂质的干扰。
(4)本实验表明利用3,5-二硝基水杨酸显色的分光光度法测定北虫草提取物中多糖的含量是可行的,方法具有操作简便、快速、精密度和回收率较高、重现性好等特点。
参考文献
[1]Li S P, Li P, Dong T T, et al. Anti - oxidation activity of differenttypes of natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia[J].Phytomedicine,2001,8(3):207- 212.
[2]肖建辉,梁宗琦,刘爱英.虫草无性型及其相关真菌多糖的研究开发现状.药学学报,2002,37(7):589-592.
[3]X iao JH,Zhong JJ,Seconda ry m etabo lites fro m Cordyce p sspec ies and their antit umo r ac ti v ity st udies, Recent Pa -ten ts B iotechnol 2007,1(2):123 -137.
[4]董文慧,消春娥,沙英威等.分光光度法测定云芝肝泰中多糖的含量.中国药科大学学报,1989,20(3):175.