摘要：应用考马斯亮蓝染色法测定大豆茎叶中蛋白质含量。结果表明，该法测定大豆茎叶中蛋白质含量是可行的，其RSD为0.25%～1.27%，回收率为94.9%～106.4%，大豆茎叶蛋白质平均含量为7.673%和11.315%。该方法简便快速，灵敏度高、重现性好、准确率相对较高，可用于微量可溶性蛋白质含量的测定。
关键词：大豆茎叶；蛋白质含量；考马斯亮蓝染色法
中图分类号：TS63 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）20-4610-03
蛋白质是一项质量和资源评价的重要指标[1]，用一种快速、准确、方便的方法来检测蛋白质含量是必不可少的。近年来，许多学者用考马斯亮蓝染色法和其他方法对蛋白质含量进行了测定[2-9]。蛋白质中的酰胺基团与考马斯亮蓝染料中的阴离子结合使溶液显蓝色，测定效果可通过测定显色稳定性等多个性状指标进行全面客观地评价。本试验采用盆栽大豆，对大豆的茎叶蛋白质含量与大豆产量进行考察，通过分析它们之间的影响与关系，为今后大豆育种工作提供试验方法。
1 材料与方法
1.1 材料
供试样品为大豆茎叶（实验室自制）。
牛血清白蛋白（进口分装），购于上海亿欣生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250（进口分装），购于中国医药（集团）上海化学试剂公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 仪器
SHB-IIIS循环水式多用真空泵和抽滤装置（郑州长城科工贸有限公司）、EL303型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Cary50紫外分光光度计（美国瓦里安有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 蛋白质标准溶液的配制 准确称取牛血清白蛋白100.0 mg，用去离子水定容至100 mL，即为
1 mg/mL蛋白质标准液，4 ℃保存待用。
1.3.2 考马斯亮蓝G-250溶液的制备 称取考马斯亮蓝G-250 100.0 mg于研钵中，取体积分数为95%的乙醇（下同）50 mL，从中取约10 mL加入研钵，将考马斯亮蓝G-250研成粉并溶解；轻轻将上层液体转入500 mL烧杯中，再取10 mL乙醇溶液于研钵中研磨，同法收集，重复洗涤3次。最后用20 mL乙醇分次洗涤研钵，合并液体于烧杯中。取体积分数为85%浓磷酸100 mL分次加入烧杯再转入
1 L容量瓶，定容，抽滤，得考马斯亮蓝G-250溶液。
1.3.3 标准曲线的绘制 分别吸取0.2～1.0 mL标准蛋白质溶液于10 mL试管中，各管补加0.15 mol/L NaCl溶液至1 mL，各取0.1 mL于新试管中并加入5 mL考马斯亮蓝 G-250溶液，摇匀，放置 2 min，于595 nm 处测定其吸光度[7]。
1.3.4 样品中蛋白质含量的测定 取样品溶液0.1 mL，按上述方法测定其吸光度，再根据标准曲线方程计算出样品的蛋白质含量[8]。
2 结果
2.1 标准曲线回归方程的建立
用紫外分光光度计，以0.15 mol/L的NaCl溶液作空白对照，在595 nm处测定对照品溶液吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线见图1。
通过测定不同浓度牛血清白蛋白的吸光度得其线性回归方程式：Y=0.478 3X+0.070 3，R2=0.999 3。
2.2 样品蛋白质含量测定结果
按蛋白质含量测定方法，同时做3个重复，大豆茎的吸光度为0.434 2、0.440 2和0.437 5 a.u.，大豆叶的吸光度为0.611 4、0.611 0和0.612 1 a.u.。计算大豆茎的蛋白质含量为7.608%、7.734%和7.677%，平均含量为7.673%；大豆叶的蛋白质含量为11.313%、11.305%和11.328%，平均含量为11.315%。
2.3 稳定性试验
量取同一样品溶液 1 mL，每隔 10 min 测定1次，观测其稳定性，结果见表1，表明在显色1 h 内吸光度稳定，RSD分别为0.04%和0.39%。
2.4 重复性试验
按上述方法，分别测定大豆茎和叶蛋白提取液的吸光度，检验该方法的重现性，结果见表2，RSD分别为0.83%和1.27%，小于5%，表明重现性较好。
2.5 精密度试验
准确吸取牛血清白蛋白溶液（1 mg/mL）0.5 mL进行精密度试验，连续测定其吸光度6次，其RSD为0.25%，小于5%，表明精密度较好，结果见表3。
2.6 回收率测定
取已配制好的1 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL，加入1 mL大豆茎（或叶）样品溶液，然后再加入5 mL考马斯亮蓝染色液，摇匀，静置2 min左右，于595 nm处测定其吸光度，以不加牛血清白蛋白溶液作为空白对照，根据标准曲线算出相应浓度，然后计算加入样品蛋白的量，并计算回收率[9]，结果见表4。结果表明，该方法准确度较高，可满足大豆茎叶中蛋白含量的快速定量分析。
3 讨论
蛋白质分子均具有酰胺基团，棕红色的考马斯亮蓝G-250染料上的阴离子与蛋白质的酰胺基团结合，使溶液变为蓝色，由于溶液在595 nm处吸光度与蛋白质含量成正比，因此595 nm处测定吸光度，可计算出样品中蛋白质含量[6]。上述结果表明，考马斯亮蓝与蛋白质中的酰胺基团结合生成的蓝色非常稳定，在1 h之内吸光度值变化很小，重复性较好，精密度较高，同时该方法测定蛋白含量的回收率符合大豆茎叶蛋白质含量的测定要求。大豆茎蛋白质提取液中蛋白质含量在0.7～1.0 mg/mL范围内；大豆叶蛋白质提取液中蛋白质含量在1.1～2.0 mg/mL范围内，用考马斯亮蓝染色法测定大豆茎叶蛋白质的含量优于其他传统方法[10，11]。但另一方面，该法线性范围窄，低浓度样品易受影响，因此，在测定时所用试管须经酸浸泡，洗净后应经高温烘干。当样品浓度大于一定浓度时，须稀释测定，另外，可用乙醇和去离子水清洗比色皿上粘染的色素[12]。综上所述，该法准确率较高且简便灵敏，对设备要求低，受干扰小，适宜于测定大豆茎叶的蛋白质含量。
参考文献：
[1] 王孝平，邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J].天津化工，2009，23（3）：40-41.
[2] 马 丹.凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量[J].计量与测试技术，2008，35（6）：57-58.
[3] 孙士青，王少杰，李秋顺，等.考马斯亮蓝法快速测定乳品中蛋白质含量[J].山东科学，2011，24（6）：53-55.
[4] 冯 昕，王吉中，尧俊英，等.考马斯亮蓝法测定乳与乳制品中蛋白质含量[J].粮食与食品工业，2010，17（3）：57-59.
[5] 黄婉玉，曹 炜，李 菁，等.考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量[J].食品与发酵工业，2009，35（5）：160-162.
[6] 王文平，郭祀远，李 琳，等.考马斯亮蓝法测定野木瓜多糖中蛋白质的含量[J].食品研究与开发，2008，29（1）：115-117.
[7] 裴显庆.用考马斯亮蓝染色方法测定蛋白质含量[J].肉类研究，1990（1）：36-37.
[8] 李 娟，张耀庭，曾 伟，等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.
[9] 刘小华，张美霞，于春梅，等.考马斯亮兰法测定壳聚糖中蛋白的含量[J].中国交通医学杂志，2006，20（2）：159-160.
[10] 王爱军，王凤山，王友联，等.低浓度蛋白质含量测定方法的研究[J].中国生化药物杂志，2003，24（2）：78-80.
[11] 王淡兮，孙秀兰.蛋白质定量检测方法的探讨[J].粮食与食品工业，2009（4）：49-52.
[12] 徐杰伟，温少磊，蔡早育.考马斯亮蓝法测定微量蛋白的条件探讨[J].江西医学检验，2003，21（5）：353-354.