摘要：从牦牛皮下采集皮蝇（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ）幼虫，用ＤＮＡ提取试剂盒、Ｃｈｅｌｅｘ－１００两种方法提取幼虫的基因组ＤＮＡ；通过ＰＣＲ扩增线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因（ＣＯⅠ）中的高度可变序列，扩增产物经ＢｆａⅠ酶切后用琼脂糖凝胶检测，结果表明所采集的皮蝇幼虫属于同一种。测序结果显示，扩增的序列与ＧｅｎＢａｎｋ中中华皮蝇（Ｈ. ｓｉｎｅｎｓｅ）相应序列的相似性为９９．５６％，表明所采集的皮蝇幼虫均为中华皮蝇。
关键词：牦牛；皮蝇（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ）幼虫；ＲＦＬＰ；细胞色素氧化酶Ⅰ；鉴定
中图分类号：Ｓ８５２．７４＋３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）07－1477-04
ＲＦＬＰ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉfiｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ Ｌａｒｖａ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｙａｋｓ
ＬＩＵ Ｈａｏ－ｈａｏ１，ＬＩ Ｙｕ－ｐｉｎｇ２，ＨＵＡＮＧ Ｚｈｉ－ｈｏｎｇ１，ＸＵ Ｙａ－ｏｕ１，ＪＩＮ Ｓｕ－ｙｕ１，ＬＩＮ Ｙａ－ｑｉｕ１， ＺＨＥＮＧ Ｙｕ－ｃａｉ１
（１.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，China；
２.Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｊｉｕｌｏｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｊｉｕｌｏｎｇ ６２２０００，Ｓｉｃｈｕａｎ，China）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＲＦＬＰ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｌａｒｖａｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｙａｋｓ． ＤＮＡ ｏｆ ｌａｒｖａｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ａｎｄ Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｏｘｉｄａｓｅ Ⅰ ｇｅｎｅ （ＣＯⅠ） ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ． ＢｆａⅠ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｌａｒｖａe ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ one ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈａｒｅｄ ９９．５６％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ Ｈ． ｓｉｎｅｎｓｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｌａｒｖａｅ ｗｅｒｅ Ｈ． ｓｉｎｅｎｓｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｙａｋ； Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｌａｒｖａ； ＲＦＬＰ； ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｏｘｉｄａｓｅ Ⅰ； ｉｄｅｎｔｉｆication
牦牛皮蝇蛆病是牦牛中常见的一种寄生虫病，该病发病率高，尤其是在１～２岁的幼龄牦牛中［１］。被皮蝇幼虫感染的牦牛会出现产奶量下降、体重减少等症状，另外皮革的质量也会受损，这将严重影响藏区畜牧业的发展［２，３］。因此，加强该病的监测及防治工作非常重要。侵袭牦牛的皮蝇种类有很多，在我国主要有中华皮蝇（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｉｎｅｎｓｅ）、牛皮蝇（Ｈ． ｂｏｖｉｓ）、纹皮蝇（Ｈ． ｌｉｎｅａｔｕｍ）３种［１，２］，其中又以中华皮蝇最为常见。有资料统计，在藏区患皮蝇蛆病的牦牛中，大约有９０％是被中华皮蝇感染，剩余两种皮蝇各占５％左右［４］。
皮蝇种类的鉴定方法已经有很多，最常见的是通过形态学特征与分子生物学特征鉴定。前者主要是用扫描电子显微镜观察皮蝇３期幼虫气门板的形态以及体节腹面突棘的分布情况［１，２，５］，后者则是根据线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（ＣＯⅠ）［１，４－７］、核糖体２８ Ｓ亚基［１］等基因的序列特征。虽然不同种类的皮蝇幼虫形态有一些差异，但是形态学鉴定需要扫描电子显微镜等大型设备，操作不是很方便。本研究使用分子生物学方法，改良皮蝇幼虫ＤＮＡ的提取方法，进行ＲＦＬＰ及测序分析鉴定采集到的牦牛皮蝇幼虫，以期建立一种快速、可靠的牦牛皮蝇幼虫鉴定方法。
１ 材料与方法
１．１ 样品的采集
牦牛皮蝇幼虫采自四川省九龙县，在牦牛屠宰时采集４头牦牛的皮下幼虫（ｎ＝１１），迅速冰冻，送至实验室后保存于－８０ ℃超低温冰箱。
１．２ 主要仪器及试剂
主要仪器：电动匀浆器（瑞士Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ１２００Ｅ）、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ＥＰ梯度ＰＣＲ仪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、Ｐｏｗｅｒ Ｐａｃ ３０００电泳仪（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｖｅｒｓａ Ｄｏｃ １０００凝胶成像系统（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。主要试剂：ＴａＫａＲａ基因组ＤＮＡ提取试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）、２×Ｔａｑ Mａｓｔｅｒ Mｉｘ（天根生化科技（北京）有限公司）、Ｃｈｅｌｅｘ－１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＢｆａⅠ（Ｆｅｒｍｅｎｔｓ）等，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
１．３ 皮蝇幼虫ＤＮＡ的提取
牦牛皮蝇２期或３期幼虫称重后，加入１０倍体积匀浆液（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ ８．０），用电动匀浆器在冰上匀浆，９ ３３０ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心２０ ｍｉｎ，上清液保存于－８０ ℃备用。
采用两种方法提取牦牛皮蝇幼虫ＤＮＡ。①取皮蝇幼虫匀浆液２５０ μＬ，参照ＴａＫａＲａ基因组ＤＮＡ提取试剂盒从全血中提取ＤＮＡ的方法进行；②参照Ａｍｉｌｌｓ等［８］的Ｃｈｅｌｅｘ－１００方法，取幼虫匀浆液２００ μＬ，用５０ ｇ／Ｌ的Ｃｈｅｌｅｘ－１００提取ＤＮＡ。提取的ＤＮＡ用琼脂糖凝胶电泳检测，并用核酸蛋白检测仪测定其浓度。
１．４ 皮蝇幼虫的分子生物学鉴定
使用Ｏｔｒａｎｔｏ等［７］设计的引物ＵＥＡ７（５′－ＴＡＣＡＧ
ＴＴＧＧＡＡＴＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＡＣ－３′）和ＵＥＡ１０（５′－ＴＣＣ
ＡＡＴＧＣＡＣＴＡＡＴＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＡ－３′）扩增皮蝇幼虫细胞色素氧化酶Ⅰ基因（ＣＯⅠ）中编码第四外环到羧基端（Ｅ４－ＣＯＯＨ）的片段。ＰＣＲ体系包括：２×Ｔａｑ Mａｓｔｅｒ Mｉｘ １２．５ μＬ，超纯水８ μＬ，ＤＮＡ模板２．５ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ ＵＥＡ７和ＵＥＡ１０ 各１ μＬ。ＰＣＲ扩增程序为：９４ ℃ １２ ｍｉｎ；９４ ℃ １ ｍｉｎ，６０ ℃ １ ｍｉｎ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，３８个循环；７２ ℃ ７ ｍｉｎ；１６ ℃保存［５］。扩增产物用１．５％的琼脂糖凝胶电泳检测，同时选取１个ＰＣＲ产物直接进行双向测序。
ＰＣＲ扩增产物用限制性内切酶ＢｆａⅠ酶切，反应体系包括ＰＣＲ产物２．５ μＬ，超纯水１５ μＬ，Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ＢｆａⅠ ０．５ μＬ。３７ ℃酶切１１ ｈ后用２．０％的琼脂糖凝胶电泳检测。
２ 结果与分析
２．１ 皮蝇幼虫ＣＯⅠ基因的ＰＣＲ扩增结果
皮蝇幼虫ＣＯⅠ基因编码Ｅ４－ＣＯＯＨ片段的ＰＣＲ扩增结果见图１。其中１～３号ＤＮＡ为试剂盒法提取，４～６号ＤＮＡ由Ｃｈｅｌｅｘ－１００法提取，二者扩增效果相同，均获得了单一的、长约７００ ｂｐ的条带。
２．２ 皮蝇幼虫ＣＯⅠ基因ＰＣＲ产物酶切
皮蝇幼虫ＣＯⅠ基因编码E4-COOH片段的ＰＣＲ产物经ＢｆａⅠ酶切、电泳检测显示，所有个体均获得了２条大小分别约为４２０ ｂｐ和２７０ ｂｐ的条带（图２），表明采集的皮蝇幼虫均属于同一种。
２．３ 皮蝇幼虫ＣＯⅠ基因ＰＣＲ产物的测序及比对结果
选取１只皮蝇幼虫ＣＯⅠ基因编码E4-COOH片段的ＰＣＲ产物进行双向测序，拼接后与ＧｅｎＢａｎｋ中中华皮蝇、牛皮蝇、纹皮蝇ＣＯⅠ基因中编码Ｅ４－ＣＯＯＨ片段的序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号分别为：ＡＹ３５０７６９、ＡＦ４９７７６１、ＡＦ４９７７６２）进行比对（图３）。结果发现该序列与中华皮蝇的相应序列只有３个碱基的差异，差异位点分别为６３、３３９、５４４，两者序列一致性达到了９９．５６％；而与牛皮蝇、纹皮蝇则分别有６０个、４７个碱基的差异，相应的序列一致性分别为９１．２８％、９３．１７％，表明本试验所采集的牦牛皮蝇幼虫均为中华皮蝇。
３ 讨论
有报道显示，在青藏高原牧区患皮蝇蛆病的牦牛中，大约有９０％是由于中华皮蝇的感染［４］。本研究根据皮蝇幼虫ＣＯⅠ基因中编码Ｅ４－ＣＯＯＨ片段的ＲＦＬＰ分析以及序列比对结果，并参考Ｏｔｒａｎｔｏ等［１］的研究结果，证实所采集的牦牛皮蝇幼虫均为中华皮蝇，与之前的报道相符［４，９］。用分子生物学方法鉴定牦牛皮蝇种类的相关研究已有不少报道［１，４－７，９］，该法在其他动物的皮蝇幼虫鉴定中也获得了可靠的结果［１０－１２］。与形态学方法相比，分子生物学方法结果准确可靠，操作也较简单，同时不需要大型仪器设备，应用前景广阔。
本研究在皮蝇幼虫ＤＮＡ的提取过程中采用Ｃｈｅｌｅｘ－１００方法，取得了很好的效果。该方法提取的ＤＮＡ用作ＰＣＲ模板时，与试剂盒提取ＤＮＡ的效果相差不大，但该法操作简单、成本低、污染小，尤其适合高通量的ＤＮＡ提取。这为今后牦牛皮蝇幼虫的大规模鉴定提供了可靠、有效的方法。
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