摘要： 蛋白质组学伴随后基因组学发展的需要而诞生，其发展迅速。果树生殖生物学的蛋白质组学是近年来的研究热点，对揭示果树生殖发育的分子机制具有重要价值。围绕果树花的发育、果实发育、胚胎发育、体胚发育4个方面阐述了蛋白质组学在果树生殖生物学研究中的应用现状。对蛋白质组学在果树学领域研究中存在的不足进行了讨论，认为分析技术手段的多样化、分析层次的多元化及与其他学科的紧密融合是果树生殖发育蛋白质组学的主要发展趋势。
关键词： 果树； 生殖； 蛋白质组学
植物生殖生物学（Plant Reproductive Biology）是指运用植物解剖学、细胞生物学和分子生物学的手段和方法，研究植物生殖器官和生殖细胞的发生和发育、传粉和受精作用、胚胎发育的问题，探讨植物生殖的机理和植物生殖器官发育的规律[1]。果树植物的生活周期包括了营养生长、开花、授粉受精、胚发育及果实成熟等过程，生殖生物学就是对其生活周期中的生殖行为进行研究的科学，它涉及到除营养生长外的其他过程，具体说主要指对花芽分化、大小孢子的形成及雌雄配子体的发育、果实的发育、种子的成熟等方面的研究[2]。受精作用始终是植物生殖生物学的核心热点问题，而果实作为果树植物最有经济价值的生殖器官，其发育、成熟、品质和代谢途径一直受到果树研究者的重视。
果树生殖生物学是果树生理学的重要组成部分，对其深入研究有助于生产者在栽培过程中进行科学管理，更有助于育种者正确选择与选配杂交亲本，开展果树遗传研究与品种改良[3]。然而近年来世界果树产业的发展态势，暴露出育种环节许多新问题，例如品种的品质性状难以取得突破；病虫害也严重影响了果实的产量和品质；极端恶劣天气如干旱、严寒的发生，对砧木抗性的要求也越来越高。这些问题的出现，导致单纯通过植物解剖学或细胞生物学等手段和方法，已不能使生殖生物学研究为现代果树育种工作提供更广泛的机理性信息，迫切要求人们从基因水平上解析控制果树重要农艺性状的分子机制。全基因组测序数据，为世界果树基因组学的研究奠定了重要的信息基础。但是果树的基因组相对庞大，测序任务进展缓慢，目前所有果树中，仅有葡萄[4]、番木瓜[5]、林丛野草莓[6]、桃[7]、柑橘[8]、苹果[9]和甜橙[10]等完成了测序。桃近年来被认为是蔷薇科果树的模式树种，我国于2010年10月启动了基因组的重测序工作。利用生物信息学方法对全基因组测序结果进行基因注释，开展其重要性状相关基因的发现、克隆、功能验证和进化分析，将有助于从基因水平上分析果实包括色、香、味、成熟期等重要性状，培育更多优良的果树新品种。至此果树学研究跨入了新的功能基因组研究时代，即后基因组时代。蛋白质组学作为功能基因组学的一个重要研究手段，近年来逐渐成为果树生殖生物学研究新的热点。
1 蛋白质组学概念的提出及蛋白质组学的主要研究技术
“蛋白质组（proteome）”的概念最早由澳大利亚科学家Wilkins等于1994年提出，并于1995年7月在《Electrophoresis》杂志上发表[11]。它指的是一个基因、一个细胞或一个组织所表达的全部蛋白质，与基因组相对应，是一个整体的概念。由于从基因到蛋白质存在着转录水平、翻译水平及翻译后修饰等作用的调控，仅从mRNA角度考虑，实际上只包括了转录水平的变化，并不能完全代表蛋白质表达的真实水平[12]。虽然植物mRNA与表达的蛋白质存在相关性，但其相关程度并不高，相关系数常低于0.5[13]，因此，要精确的研究各种基因的功能，还是要回到执行生命功能的蛋白质本身上来，由此产生了一门新的学科——蛋白质组学（proteomics）。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，从蛋白质水平入手，整体、动态、定量地去研究正在工作的基因组，是后基因组时代的一个重要组成部分[14-15]。
蛋白质组学主要以分离技术和生物质谱技术为支撑平台，生物信息学为桥梁，对蛋白质表达进行研究分析[16]。近年来，蛋白质组学技术有了长足的发展，其核心三大技术也获得了较大突破：固相化pH梯度胶条即IPG胶条的发明和完善；2种软电离质谱技术的出现；蛋白质双向凝胶电泳图谱数字化和一系列分析软件的问世，极大地促进了蛋白质组学的发展及其在其他学科中的应用。
2 蛋白质组学在果树生殖生物学中的应用
蛋白质组学研究技术具有高通量、全面性和整体性等特点，随着蛋白质组学研究数据的不断积累，方法学的不断创新和突破及各种方法间的整合和互补，给果树生殖生物学分子机理研究带来了新的机遇。
2.1 花发育
花是果树重要的生殖器官。利用蛋白质组学技术研究表明在果树花芽分化、完全花与不完全花的发育及正常成花与成花逆转不同发育时期，蛋白质均存在差异表达，而这些差异表达的蛋白正是导致不同形态花发育的直接原因。
在荔枝雌花发育的大孢子成熟期，蛋白质含量最高[17]。富士苹果树短枝停长后的21～42 d叶芽和花芽的图谱相同，从短枝停长后的第7周开始花芽图谱检测到蛋白点数量有所增加，而叶芽的图谱没有变化，表明花芽分化前后蛋白质代谢复杂，伴随一些蛋白质的消失以及花芽分化的特异蛋白质的出现[18]。果梅完全花与不完全花的蛋白分布相似，在完全花中发现了1个特异蛋白、1个上调蛋白、21个下调蛋白，在不完全花中发现2个特异蛋白，这些蛋白差异点可能与雌蕊的败育有关，对3个特异点及5个差异大的蛋白点进行分析，得到的肽段数据与蛋白质数据库比对发现其中一个蛋白与光敏色素B有关[19]。另外，物质和能量代谢相关蛋白、转录和翻译相关蛋白、次生代谢相关蛋白、调控相关蛋白、抗逆相关蛋白和细胞骨架蛋白可能影响了龙眼花芽的正常发育，进而导致了成花逆转[20]。
2.2 果实发育
果实是被子植物（显花植物）特有的生殖器官，通常在开花授粉之后，以受精的子房为主体而形成。一般果实的发育需要经历从授粉、受精以及相对漫长的果实膨大期直到最后的着色和成熟过程。果实最终成熟是一系列与发育成熟相关基因时空表达以及相互作用的结果，蛋白质组学作为一种技术可以使我们更深入了解果实发育成熟的分子机理[21]。 2.2.1 果树授粉、受精机制 授粉是一般果实发育的第一步，它需要正常发育的花柱和花粉相互作用，同时需要多种物质的参与和多重基因的调控。受精通常是果实发育的基础，是一个高度复杂的生理生化和形态变化的过程，涉及细胞的识别和一系列基因活性的变化，因此它必然会引起子房组织内一系列复杂的生理和代谢变化[22]。笔者应用差异凝胶电泳（DIGE）、质谱（MALDI-TOF/ TOF）和生物信息学技术，对猕猴桃授粉前和授粉后10 h的花柱蛋白质组变化进行了分析，以差异点的相对丰度比率>2.5为标准，发现有24个蛋白质点的丰度在两个样品间存在显著差异，成功鉴定了18个差异蛋白质点，它们主要是蛋白质水解、细胞壁代谢以及与逆境胁迫响应、糖类和能量代谢等有关的蛋白质；另外，我们对猕猴桃受精前后子房蛋白质组变化进行了分析，在授粉前（未受精）及授粉后120 h（通过石蜡切片观察证明已完成双受精）的子房中共检测到约1 500个蛋白质点，其中有55个差异表达的蛋白点，质谱鉴定了差异2.0倍以上的蛋白质点13个，主要是次生代谢、氧化还原、水解等有关的蛋白质。
2.2.2 果实发育机制 果树完成受精作用以后，参与形成果实的各部分结构经过复杂的代谢途径，最终发育成果实。桃果实中果皮由子房壁的中层发育而来，并由多层营养丰富的薄壁细胞构成，为可食部分；子房壁的内表皮发育成内果皮，含多层细胞，呈厚壁化、石细胞化，形成硬核[23]。在桃果实发育早期（花后28～59 d），内果皮和中果皮中差异表达的蛋白主要参与各种代谢活动，其中丙酮酸脱氢酶可能在内果皮的木质化中发挥重要作用[24]。在硬核期（盛花后56 d），差异表达的蛋白可能会进一步解释内果皮与中果皮不同的代谢方向提供理论依据[25]。
果皮可以保护果实免受物理损伤和微生物侵染，果皮颜色的变化有助于了解果实所处的不同成熟阶段，是了解果实成熟的标尺。葡萄果皮和果肉的蛋白质组差异，主要存在于苯丙烷代谢途径、氨基酸代谢、能量代谢、生物和非生物胁迫反应相关蛋白等，果皮和果肉在胁迫条件下（新梢水势-0.86MPa vs-0.58MPa）的蛋白质组差异变化也存在不同[26]。在转色期前后，与葡萄果实表面蜡质和萜类化合物合成相关的乙酰CoA转乙酰酶、柠檬酸裂解酶以及与氨基酸代谢有关的甲硫氨酸合酶、谷氨酸脱氢酶等大量表达；在果实成熟过程中，糖酵解能力下降，细胞骨架进行了重新排列[27]。与葡萄着色后期相比，有11个蛋白在着色初期出现上调表达，分别参与光合作用、碳水化合物代谢、胁迫反应和传导途径；而在着色后期，有20个蛋白出现上调表达，多数是花青素合成的关键酶，另外还有参与碳代谢和有机酸代谢的酶类，这些酶类的变化导致了葡萄成熟后期色泽和风味的变化[28]。葡萄成熟过程中，与基础代谢的成熟相关蛋白（包括糖酵解最后五步的蛋白）在果皮中被诱导表达[29]。另外，柠檬果实外皮含有大量的微生物糖类蛋白Cit s1（人类的一种抗原）异构体，分子量在20～120 ku[30]。
2.2.3 果实成熟、衰老机制 通常判断果实采收成熟度的依据主要是根据果色、硬度和可溶性固形物等，这些指标容易受品种、生长条件和季节的影响，因此有必要寻找不受外界环境因素影响的指标来判断果实的成熟度。在果实成熟衰老的研究中将蛋白质组学与上游的基因组学、转录组学和下游的代谢组学、表型组学相结合，可以更加系统地阐述果实的生理代谢过程[31]。研究发现，在日本李、欧洲李、桃和油桃4种核果类果实的最佳采收期均有4个特异蛋白合成（Z1、Z2、Y和X），它们属于一系列参与防御的抗原物质，可以作为判断桃、李和油桃果实最佳成熟度的一种新方法[32]。
不同类型果实的成熟过程在生理生化、物质组成和结构方面有着较大的差异。根据成熟过程的特征，果实可以分为呼吸跃变型和非跃变型2种类型。桃是典型的呼吸跃变型果实。软溶质和硬溶质两个品种的桃果实在跃变前后有53个蛋白差异表达，这些蛋白分别参与了基础代谢、次级代谢、乙烯合成以及胁迫反应，其中ACC氧化酶在桃果实跃变前后变化最为显著，其次是腺苷甲硫氨酸合成酶和β-氰丙氨酸合成酶，这3种酶都参与了乙烯的生物合成和代谢，在果实成熟过程中发挥着重要作用；蔗糖合成酶和α-淀粉酶在软溶质和硬溶质的桃果实中存在差异表达，这2种酶与果实的品质变化密切相关，并且软溶质桃果实中的活性氧含量要高于硬溶质，由此推测呼吸跃变型果实在成熟过程中承受的氧化胁迫较大，更容易腐烂变质[33]。
在苹果[34]、桑椹[35]、荔枝[36]、草莓[37]、柑橘[38]等果实成熟机理的研究中发现，都存在能量代谢蛋白及与胁迫和防御相关的蛋白，表明在果实成熟过程中，经历了复杂的物质、能量代谢和信号的转导。另外，通过在柑橘[38]和草莓[39]上的研究表明，鲜艳果实比普通果实类黄酮合成的酶类表达较多，在成熟过程中合成较多的花色苷，起到抗胁迫的作用；普通果实比鲜艳果实合成较多的自身防御相关的蛋白进行自我防御。
2.3 胚胎发育
植物胚胎分化发育的过程是基因在机体内外因素的作用下，在时间和空间上顺序表达的过程，其表达的方式是以合成某种蛋白质为主。由于这些蛋白质很可能是胚胎发育时期特异基因表达的产物，与该时期细胞的功能或组织的形态建成及机体的生理生化变化密切相关，因此作为一种重要的分子标记，特异蛋白为研究胚胎分化过程的基因表达调控提供了物质基础，对认识胚胎分化发育的分子本质具有重要的意义[36]。
为研究焦核龙眼焦核率的不稳定性原因，在‘白核’龙眼种子败育4个不同时期，共鉴定出了12个差异蛋白，这些差异蛋白质与能量和物质代谢、分子伴侣功能、自由基清除和抗氧化作用、细胞凋亡等生理过程密切相关，可能参与了龙眼种子败育过程[40]。从荔枝[41]、龙眼[42] 2种水果胚胎发育研究表明，胚胎发育不同时期，具有发育阶段特异性蛋白出现，这些特异蛋白与组织或细胞在该时期的特定生理功能有关，为研究胚胎发育的基因调控及分子机理研究提供了有价值的参考资料；而且，胚胎发育前期蛋白质旺盛合成与积累，表明胚胎基因在前期表达活跃，与胚胎所处的生理状态相一致。 2.4 体胚发育
体细胞在适宜的环境和激素诱导条件下脱分化形成胚性愈伤组织，胚性愈伤组织在适宜的光照、温度和激素浓度等条件下形成体细胞胚，并进一步发育成完整的植株，这个过程是果树基因工程的重要途径，用于新品种的培育与改良、基因功能的验证等。在植物体胚发生蛋白质组学研究方面，早在蛋白质组学术语正式提出前就已有相关的研究，但前期的研究主要是对拟南芥、胡萝卜、棉花、云杉等体胚发生模式植物特异分子量等电点的蛋白以及蛋白表达谱进行研究[43]。
随着蛋白质组学的提出和支持其研究的三大技术的发展，近几年来果树植物体胚发生蛋白组学研究也不断深入，如甜橙[44]、葡萄[45]、枣椰子[46]、龙眼[47-49]等果树植物已开展了体胚发生蛋白质组学研究。这些研究的共同特点是，发现了大量有阶段差异表达的蛋白，对这些差异表达蛋白进一步质谱分析鉴定，在成功鉴定的蛋白质中，以糖和能量代谢调控相关的蛋白、氧化胁迫反应相关的蛋白比例较大，未知蛋白的比例也比较高。这种现象说明了植物体细胞胚胎发生过程中，氧化胁迫可能是体胚发生的首要条件，而这种状况的维持需要源源不断的能量供应，这是植物体胚发生的物质基础。另外，在植物体胚发生过程中，一些未知功能蛋白可能是调控体胚发生、发育的关键因子，值得进一步研究，最终了解其在植物体胚发生过程的功能。
3 讨论和展望
植物细胞中包含许多次生代谢物质，可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化[50]。而从果实组织中提取蛋白质更加困难，可能是由于果实中蛋白质含量相对较低，并且含有大量干扰性物质，如色素、淀粉、多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等，对高纯度蛋白质的提取也有一定的难度[51]。需要进一步探讨与优化果树蛋白质组学的分离与鉴定研究技术。同时，蛋白质组学技术尚存在一些不足，如：双向电泳的分辨率有限、低丰度蛋白质点难以检测等，随着蛋白质组学技术的发展，液相色谱与质谱联用技术的应用在一定程度上可以弥补这些不足。另外，蛋白质组学的研究需要借助基因组数据库，目前已完成测序工作的果树资源不是很多，限制了在果树学领域进行广泛的蛋白质组学研究，所以非测序植物的蛋白质谱鉴定率不理想，果树表达序列标签（EST）数据库的飞速增长可能有助于缓解这一问题。
果树生殖发育是一个复杂的生理过程，由多种基因控制。发育过程中启动特异的基因表达从而出现特异的蛋白质。通过研究其特异蛋白质的出现、结构与功能、基因的表达与调控，对揭示果树繁殖、发育机理具有重大的理论和现实意义。目前，蛋白质组学应用于果实生殖生物学的研究处于起步阶段，重点在于对发育和成熟过程的差异表达蛋白进行鉴定和功能分析。越来越多的新技术、新方法将会随着现代分子生物学实验技术的不断完善、发展而涌现，这些新技术应用于与果树生殖发育相关的研究系统中，将为该领域研究的发展起到重要推动作用。分析技术手段的多样化、分析层次的多元化及与其他学科的紧密融合是果树生殖发育蛋白质组学的主要发展趋势。
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