[摘要] 目的 研究蛇床子素（osthole，OST）对T24/ADM 细胞多药耐药的逆转及对P-gp表达、功能的影响。 方法 采用MTT法筛选OST对T24/ADM 细胞无毒或低毒浓度，以筛选出的浓度作为耐药逆转的实验浓度。分别利用MTT法分别检测阿霉素（adriamycin，ADM）、氟尿嘧啶（fluorouracil，FU）及顺铂（cisplatin，DDP）对细胞株T24和T24/ADM以及OST处理后的T24/ADM细胞的半数抑制浓度IC50。用流式细胞仪测定OST对T24/ADM 细胞上P-gp 表达的影响。 结果 浓度17 μmol/L OST对T24/ADM无明显细胞毒性，T24/ADM对ADM、FU和DDP均有不同程度的。耐药，耐药倍数分别为18.86、5.09、3.28，使用17 μmol/L OST处理后T24/ADM对上述ADM、FU和DDP的敏感性均有不同程度的提高，ADM对耐药细胞株的IC50由（0.962±0.017） μg/mL 降至（0.364±0.031） μg/mL，逆转指数为2.64；FU对耐药细胞株的IC50由（0.723±0.003） μg/mL降至（0.463±0.021） μg/mL，逆转指数为1.56；DDP对耐药细胞株的IC50由（0.664±0.007） μg/mL降至（0.587±0.016） μg/mL, 逆转指数为1.13，使T24/ADM细胞内P-gp 蛋白表达明显下降，下降了16.32%（P ＜ 0.05）。 结论 蛇床子素在体外能部分逆转T24/ADM的耐药性，逆转机制可能是通过抑制P-gp蛋白表达实现的。
[关键词] 蛇床子素；T24/ADM细胞；耐药逆转；机制
[中图分类号] R737.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）03（a）-0007-03
Reversal effect and mechanism of osthole on the multidrug-resistance of human bladder cancer cells T24/ADM
WANG Xiaohua1 ZHANG Shaojin1 GUO Xiang1 SUN Mengliang1 LI Qinpeng1 LIU Hongyao2
1.Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China；2.Department of Urology, Shanxi Da Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective To study the reversal of osthole on the role of drug resistance T24/ADM cells. Methods The low or no cytotoxicity concentration of OST for T24/ADM cells by MTT, and take these concentrations as the experimental concentrations. The inhibition rate of ADM, FU, DDP without and with no cytotoxicity concentration of OST to T24 and T24/ADM cells were evaluated With MTT assay. The IC50 of different agents was counted. The concentrations of P-gp in T24/ADM cells with and without OST were measured by flow cytometey（FCM). Results Osthol at the concentration of 17 μmol/L had no significant cytoxicity to T24/ADM cells. T24/ADM cells were resistant to ADM, FU and DDP and the resistance index was 18.86, 5.09, 3.28 respectively. The sensitivity of T24/ADM to ADM, FU and DDP was significantly increased by osthol in the concentration of 20 μmol/L. The inhibitive concentration 50 ( IC50) of ADM declined from (0.962±0.017) μg/mL to (0.364±0.031) μg/mL with a reversion index of 2.64. The IC50 of Fu declined from (0.723±0.003) μg/mL to (0.463±0.021) μg/mL with a reversion index of 1.56. The IC50 of DDP declined from (0.664±0.007) μg/mL to (0.587±0.016) μg/mL with a reversion index of 1.13. FCM results indicated that the positive expression rate of P-gP dropped (P ＜ 0.05). Conclusion Osthole had the reversal effect on T24/ADM cell resistance, the mechanism of reversion is related with down regulation of expression of P-gp.
[Key words] Osthole; T24/ADM cells; Resistance reversal; Mechanism
膀胱肿瘤是最常见的泌尿生殖系肿瘤，目前膀胱肿瘤的治疗手段仍以手术、化疗、放疗为主。术后膀胱灌注化疗是治疗非肌层浸润性膀胱癌的重要的辅助治疗手段，但是其总体治疗效果仍不能令人满意，化疗后仍有40%~80%的复发率，肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性（multidrug resistance，MDR）是化疗失败的主要原因[1]。多药耐药是指肿瘤细胞在接触某种抗肿瘤药物后，对其产生耐药的同时可对其他结构和作用机制不同的抗肿瘤药物也产生耐药性。
MDR是当今化疗的难题，阐明耐药机制，寻找有效的逆转剂一直是国内外研究的热点。多药耐药发生的机制非常复杂，是肿瘤细胞内部多种因素作用的结果，其中多药耐药基因1（MDR1）编码的细胞膜糖蛋白P-gp 过度表达是研究最多的理论，被认为是耐药形成的最主要的原因之一[2]。近几年研究发现，某些从植物中提取的生物活性成分一旦与某些化疗药联合应用就可以明显提高这些化疗药的杀伤性[3-4]。蛇床子素，别名为喔斯脑，系从蛇床子中提取的一种香豆素类化合物，其化学名为7-甲氧基-8异戊烯基香豆素[5]，已有学者发现OST可逆转肿瘤的MDR[6]。本研究采用人膀胱肿瘤T24/ADM细胞为研究对象,观察在OST干预下ADM、FU及DRN对T24/ADM细胞生长的抑制以及细胞内P-gp 浓度变化，探讨OST对T24/ADM细胞多药耐药的影响以及初步探讨逆转多药耐药的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 细胞系T24由山西省肿瘤医院实验室提供，T24/ADM细胞为山西医科大学第一医院泌尿外科实验室提供。
1.1.2 试剂 OST购自中国药品生物制品鉴定所；ADM、FU及DDP购自深圳万乐药业股份有限公司；二甲基亚砜（dimethyisufoxide，DMS）、RPMI-1640培养液、四甲基偶氮唑蓝（MTT）及FITC P-gp单克隆抗体购自美国Sigma公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 将T24接种于含10%小牛血清的RPMI 1640 培养基（内含青、链霉素各100 U/L），恒温37℃、5% CO2培养箱内传代培养。T24/ADM细胞接种于10%小牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养，在培养体系中加入浓度为1.0 μg/mL的ADM以维持耐药性，培养条件同T24细胞，实验前停药至少2周。
1.2.2 MTT法测定蛇床子素的直接细胞毒性试验 实验前2周将T24/ADM细胞置于培养液中培养，取对数期细胞，制备细胞悬液，调整浓度为1×104/mL，接种于96 孔板内，每孔加入200 μL（2×103个细胞/孔）细胞悬液，预培养24 h后，更换为含不同浓度OST的培养液180 μL/孔。分组实验。（1）实验组加入不同体积的OST（使终浓度分别为5、10、20、40、60、80、160 μmol/L；（2）对照组加入等体积的培养液和T24/ADM细胞；（3）空白组无细胞只加等体积的培养液。作用48 h后，行MTT法，酶标仪测定每孔OD490 nm值，计算细胞生长抑制率（IR）。抑制率（%）=（1-实验组OD值/ 对照组OD值）×100%。以抑制率为纵坐标，药物对数浓度为横坐标轴绘制该细胞株的药物剂量―效应曲线图，同时计算细胞生长抑制50%的药物浓度（IC50）值及细胞生长抑制10%的药物浓度（IC10）值，确定生长率>90%的药物浓度作为逆转浓度。
1.2.3 MTT法检测T24/ADM细胞多药耐药性 取对数生长期T24和T24/ADM细胞以2.5×104/mL分别接种于96孔培养板，培养过夜后分别加浓度为0.01、0.1、1、10 μg/mL的化疗药ADM、FU及DDP，实验分组如下：（1）细胞分组，T24和T24/ADM两组，（2）实验分组，实验组为3个药物组 (180 μL细胞悬液+20 μL药物)、对照组（180 μL细胞悬液+20 μL细胞培养液）、空白对照组（200 μL细胞培养液）。药物作用24 h，行MTT法，通过由IR分别对ADM、FU及DDP浓度做剂量效应曲线，分别求出细胞生长抑制50%的ADM、FU及DDP浓度，即IC50。计算各药耐药倍数，耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。
1.2.4 MTT法检测OST的多药耐药逆转作用 取对数生长期T24/ADM细胞以细胞密度2.5×104/mL分别接种于96孔板内，培养过夜，实验分如下3组进行，实验组：17 μmol/L的OST分别与浓度为0.01、0.1、1、10 μg/mL的化疗药的ADM、FU及DDP联用，作用于T24/ADM细胞。对照组：不含OST，单独不同浓度梯度的ADM、FU及DDP联用，作用于T24/ADM细胞。空白组：不含细胞的培养基。实验操作同前，每组设3个复孔。药物作用24 h后，利用MTT法，做抑制率曲线。计算逆转倍数，逆转倍数=耐药细胞逆转前IC50/耐药细胞逆转后IC50。
1.2.5 蛇床子素对T24/ADM细胞表面P-gp表达的影响 T24/ADM细胞分实验组（OST+T24/ADM细胞）和对照组，取对数生长期的细胞105/mL，OST作用72 h后收集细胞，用胰酶将T24/ADM细胞消化成细胞悬液（4×105个/mL），用PBS洗2次，75％乙醇固定至60 min，离心吸弃乙醇固定液，PBS洗2次，加FITC标记的P-gp单克隆抗体，室温避光孵育30 min，上机检测荧光强度得出P-gp阳性表达率。实验重复3 次，取平均值。
1.3 统计学处理
用SPSS 17.0软件进行数据处理，以t检验、单因素方差分析比较两组和多组间的（x±s）；线性相关与直线回归分析两个变量之间的相互关系。
2 结果
2.1 蛇床子素对T24/ADM细胞毒性试验
蛇床子素能够抑制T24/ADM细胞生长，抑制作用随着药物剂量的增加而增强，呈剂量依赖关系，抑制率与药物浓度呈正相关，通过直线回归法分析出OST浓度（x）与抑制率（y），y=-1.717 4+0.676 1x，计算OST的IC50为76.49 μmol/L及IC10为17 μmol/L，提示17 μmol/L浓度或者更低浓度的OST对T24/ADM无明显细胞毒性作用，故将该浓度段的蛇床子素作用认为是无毒效应。故选OST浓度为17 μmol/L作为逆转剂量。
2.2 T24/ADM对ADM、FU及DDP的多药耐药性
结果见表1，ADM，FU及DDP对T24/ADM的IC50明显高于T24，两者相比较差异有统计学意义（P ＜ 0.01），表明T24/ADM呈现多药耐药，可以作为研究耐药逆转的细胞系。
2.3 蛇床子素对T24/ADM细胞药敏性的影响
结果见表2，加入OST后ADM，FU及DDP对T24/ADM的IC50均明显降低（与加入前相比较，P ＜ 0.01）。
2.4 蛇床子素对不同细胞表面P-gp表达的影响
OST作用前后，P-gp蛋白表达的荧光强度值分别为（92.13±0.31）和（75.71±0.42），两者间差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表3。
3 讨论
MDR是化疗失败的主要原因，克服肿瘤细胞的MDR，增加肿瘤对化疗药物的敏感性，提高化疗药物的疗效已经成为肿瘤化疗亟待解决的关键性问题，具有重要的临床意义。体外被证实有逆转活性的药物有很多，如环孢霉素，异搏定等，但由于他们对心、肾的毒性，限制它们在临床应用价值。因此国内外学者正积极从天然植物中寻找高效，低毒的多药耐药逆转剂，药理学研究证实理想的MDR逆转剂应具备毒副作用低而本身有抗癌活性两个基本特点。近年来国内外有关蛇床子素及其他香豆素成份的药理研究获得了很大进展，尤其是在抗诱变、抗肿瘤作用方面的突出作用及特点为其在肿瘤的预防和配合抗肿瘤药物应用方面展示了新的前景，资料显示蛇床子素对人类白血病（HL-60）、宫颈癌（Hela）、结肠癌（Colo205）细胞有很强的抑制作用[7-9]。以BALB／C裸鼠为实验对象，观察到蛇床子素可抑制肺鳞癌和肺腺癌癌体的生长（抑瘤率分别为60．9％和50％）[10]；以小鼠为研究对象，发现蛇床子素对荷瘤鼠宫颈癌（U14）、肉瘤（S180）、肝癌（H22）体内肿瘤有明显抑制作用（抑瘤率分别为60.0％、68.2％和62.1％），而对小鼠的肝、脾指数和胸腺指数几乎无影响，显示出OST高效低毒的特点[11]。张庆林等[12]的研究表明，蛇床子香豆素成份欧芹属素乙，爱得尔庭，9-异丁酰氧基-O-乙酰基哥伦比亚苷元对耐肿瘤细胞KBV200有明显的逆转作用。
本研究对象人膀胱癌多药耐药细胞株T24/ADM 由ADM诱导亲本细胞株T24而建立，对ADM及多种化疗药物耐药，是较为经典的MDR细胞模型，其主要机制为P-gp高表达，使化疗药从细胞内泵出增加。本研究结果证实了T24/ADM对ADM, FU 和DDP存在交叉耐药，耐药倍数3.28~18.86不等。本实验在无毒浓度蛇床子素（17 μmol/L）作用下可以显著地将ADM和FU、DDP的半数抑制浓度分别降低2.64 和1.56、1.13倍, 耐药肿瘤细胞T24/ADM 对ADM 和FU、DDP的敏感性显著增加，可以认为在无毒剂量条件下, 蛇床子素是一种有效的MDR 逆转剂。实验发现加入17 μmol/L 的OST后，ADM, FU 和DDP对T24/ADM的IC50仍远高于对T24的IC50，说明OST仅为部分逆转。流式实验结果显示:T24/ADM细胞表面P-gp蛋白高表达, 表达率为92.13%，P-gp蛋白高表达可能是造成其耐药的原因之一，当20 μg/mL蛇床子素处理后T24/ADM细胞表面P-gp 表达下明显，下降了16.32%，增加了耐药细胞对各种化疗药物的敏感性，从而达到逆转T24/ADM细胞的耐药性的目的。
总之，蛇床子素在无毒浓度条件下能体外逆转人膀胱癌细胞的阿霉素耐药，其机制可能为蛇床子素对T24/ADM细胞的P-gp活性的抑制，如果能进一步在体内实验中证实蛇床子素MDR逆转作用，它可能会成为一种新的逆转体内MDR的天然药物。
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（收稿日期：2012-01-12）