研究表明细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）自线粒体释放入胞浆是诱导细胞凋亡的关键环节。Bcl-2基因家族是细胞凋亡过程中一类重要的调节因子，包含两类功能相反的基因：一类是抑制细胞凋亡的基因，如Bcl-2和Bcl-W等；另一类是促进细胞凋亡的基因，如Bax、Bak和Bcl-Xs等。该家族成员中抑制与促进细胞凋亡的基因表达之比决定了细胞在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡[1-3]。本文试图从亚低温对创伤性脑损伤后海马CA2、CA3区Cyt-C表达与Bcl-XL和Bcl-XS家族凋亡因子表达的影响入手，揭示亚低温的部分神经保护机制，为临床治疗脑创伤患者提供一定的理论依据。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 主要试剂 甲苯胺蓝：（本院病理中心实验室提供），Cyt-C检测试剂盒：（Santa Cruz Biotechnology， Inc.），Bcl-XL和Bcl-XS原位杂交检测试剂盒：（武汉博士德生物生物工程有限公司），链霉素抗生物素蛋白、过氧化物酶免疫组化染色试剂盒（SP）：（天津灏洋生物制品科技有限公司），多聚赖氨酸：（天津灏洋生物制品科技有限公司），DAB显色液：（天津灏洋生物制品科技有限公司），氯化琥珀胆碱：（本院麻醉科提供）1.1.2 主要仪器设备 DH-140型动物人工呼吸机：（浙江医科大学医学仪器实验厂），改良Feeney自由落体打击装置：（自制），Olympus光学显微镜：（日本），Motic病理图像分析系统：（北京航空航天大学），HH-s恒温水浴箱：（金坛市医疗仪器厂），隔水式电热恒温箱：（湖北省黄石市医疗仪器厂），PIKA切片机：（日本），JEM-100CX透射电子显微镜：（日本），免疫组化湿盒，染色缸，微量移液器。1.1.3 实验动物 健康雄性SD大鼠36只（河南省实验动物中心提供），体质量300～350 g，采取自然光照，自由进食喂养，喂养3 d后制作颅脑损伤动物模型。1.2 实验方法1.2.1 实验动物分组1.2.1.1 Cyt-C检测组随机（随机数字法）分成三组（假手术/常温组/亚低温组），每组6只大鼠。1.2.1.2 Bcl-XL和Bcl-XS原位杂交 检测随机（随机数字法）分成3组（假手术/常温组/亚低温组），每组6只大鼠。1.2.2 大鼠脑挫裂伤模型处理方法 以10%水合氯醛按照350 mg/kg腹腔内注射麻醉大鼠后，将其头部固定，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，沿中线左侧矢状切开头皮，剥离骨膜显露左顶颅骨，于中线左侧旁开约2 mm、前囱后约2 mm处用牙科钻开一直径5 mm圆形骨窗，保持硬膜完整。以40 g砝码于25 cm高处通过金属导杆落下，撞击置于硬脑膜上的圆锥上致重型脑挫裂伤。骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。气管切开，置入气管插管，腹腔注射氯化琥珀胆碱（5 mg/kg）松弛肌肉，避免动物寒战影响亚低温效果。呼吸机辅助呼吸（呼吸频率80次/min，吸呼比1∶2，潮气量约14～16 ml/kg）。脑外伤后亚低温治疗组用冰毯及冰袋物理降温，使大鼠肛温在15 min内控制在30.0～31.0 ℃（相当于脑温33.0～34.0 ℃），全身亚低温治疗维持2 h，脑温的测量和维持用点式测温仪测量大鼠肛温间接代替脑温，脑温的维持在脑外伤后立即进行。脑外伤后常温组采用局部加热法，用60 W白炽灯距头顶照射，使大鼠肛温维持在36.5～37.5 ℃（相当于脑温37.5～38.5 ℃），脑温的高低通过调节灯泡与大鼠头部的距离来完成。2 h后，待大鼠清醒，恢复自主呼吸后，拔除气管插管，缝合气管切口、颈前肌肉及皮肤，置鼠笼喂养。假手术组只切开头皮，颅骨开窗，不致伤。1.2.3 标本采集及制备 Cyt-C检测组于伤后6 h后在深度麻醉状态下开胸，穿刺左心室，经心用1%肝素生理盐水，直至回流液清亮，再缓慢灌注4%多聚甲醛溶液，大鼠开始出现全身肌肉抽动、四肢僵直表明灌注成功。断头并取脑组织标本，置于10%中性甲醛固定24 h。然后冠状位切取前囟后3.3～4.3 mm处脑组织，采用免疫组织化学法测定各组大鼠脑海马区神经元中Cyt-C释放情况。Bcl-XL和Bcl-XS原位杂交检测组伤后72 h在深度麻醉状态下开胸，穿刺左心室，以10%中性甲醛经心灌流固定，断头并取脑组织标本，置于10%中性甲醛于4 ℃后固定24 h。然后取冠状位切取视交叉与正中隆起处组织，测定各组大鼠脑海马区Bcl-XL和Bcl-XS的表达情况。1.2.4 Cyt-C阳性神经元 采用免疫组化检测法[4]。1.2.5 Bcl-XL和Bcl-XS 采用原位杂交检测法[4]。1.2.6 计数方法 在本实验所采用的打击方案中，受力的中心部位在大鼠海马CA2-CA3区（包括CA2与CA3交界部），故该区变化最为明显。所以笔者选取此部位进行观察，在Motic病理图像分析系统下，测量Cyt-C阳性细胞积分光密度值、凋亡细胞平均灰度值，以此间接反映其相对含量。1.3 统计学方法计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，用SPSS 13.0统计分析软件进行分析。分类变量使用χ2检验或Fisher’s确切检验，组间比较采用SNK-q检验，以P2 结果2.1 Cyt-C免疫组化结果亚低温组Cyt-C阳性细胞光密度值与常温组相比，在2～72 h，P 2.2 Bcl-XL和Bcl-XS的检测结果与常温组相比，Bcl-XL和Bcl-XS的表达有所不同，Bcl-XL表达下降的时间后延，至损伤后7 d仍有表达，Bcl-XS于损伤后24 h开始增加，72 h达到峰值。如图2所示，Bcl-XL和Bcl-XS的比值均大于1.6，与常温组各时间点比较，差异均具有统计学意义（P3 讨论亚低温（mild hypothermia，MHT）是Busto[1]等1987年首次提出的概念，即采用物理手段将全身体温下降至32～35 ℃，在避免了深低温副作用的同时，同样具有保护脑神经功能的作用。国内由江基尧[2]于20世纪90年代提出并被广泛应用。从此，国内外学者也开展了亚低温治疗脑缺血和脑外伤的实验和临床应用的研究。关于亚低温的神经保护机制，报道认为[5-6]抑制神经元凋亡可能是亚低温发挥其脑保护作用的一个途径。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动性死亡过程，是引起神经元迟发性死亡的重要机制。研究表明，缺血性或创伤性脑损伤后的脑细胞死亡通过细胞坏死（cellular necrosis）和细胞凋亡（apoptosis）两种方式实现[7-9]。轻度缺血主要引起细胞凋亡，严重缺血则导致细胞坏死。细胞坏死主要发生在缺血90 min以内，90 min后细胞死亡的方式以细胞凋亡为主。目前认为神经细胞的凋亡受凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-x及凋亡促进基因Bax、p53、p21的控制，其中最受关注的是Bcl-2和Bax。凋亡发生的机制主要是在凋亡信号因子的作用下线粒体内的细胞色素C（holo-cythochrome C）大量释放，激活了一组半胱氨酸蛋白酶（caspases），从而导致细胞发生程序性死亡。目前的研究表明，亚低温有防止脑缺血、脑损伤后脑细胞的坏死以及细胞凋亡的作用。原癌基因Bcl-2可能是一种后期基因，在早期反应基因的激活下表达增加，合成保护性蛋白Bcl-2，抑制细胞凋亡。Yenari等[10]发现亚低温可使脑缺血TUNEL阳性细胞减少。他们同时还发现亚低温组Bcl-2的表达增加，有害蛋白Bax、Fas、Cyt-C、和caspase-3基因的表达均较常温组明显减少。Shibano等[11]在实验研究中发现30～35 ℃能抑制脑细胞的凋亡，细胞凋亡率和细胞毒性下降显著，而30 ℃以下则可诱导实验脑细胞的凋亡，体温为37℃时实验脑细胞的细胞毒性和凋亡率分别增加60%和90%。Xu等[4]在实验中发现，亚低温（33 ℃）治疗24 h后能显著地降低动物神经细胞的细胞毒性和细胞凋亡率，认为这种脑保护作用的机理是亚低温减少了Cyt-C的移位，减少即早基因（immediately early genes，IEG）家族中（C-Jun）致活酶的活化，从而防止了caspase的活化。Cohen认为caspases一经激活将导致底物裂解，细胞凋亡将不可逆地进行下去，因此，caspase被认为在介导细胞凋亡的过程中发挥关键作用，是细胞凋亡的重要标志。本实验部分按照改良Feeney自由落体脑损伤模型方式制作左顶叶重型脑挫裂伤模型，通过第一部分的实验笔者发现大鼠脑挫裂伤后海马区神经细胞Cyt-C释放、凋亡具有明显的时相性。海马区神经细胞Cyt-C释放于伤后6 h达高峰，凋亡于伤后72 h达高峰。大量的文献报道表明，亚低温超过0.5 h都有明显的脑保护作用[12-14]，于是笔者于伤后采取亚低温治疗，亚低温的时程为2 h，分别于伤后6 h、72 h取材，观察亚低温的疗效。本研究应用抗大鼠已激活的结合状态Cyt-C抗体，检测了大鼠脑挫裂伤后海马CA2-CA3区神经元中Cyt-C表达情况，并在施加亚低温处理因素后探讨亚低温对Cyt-C释放的影响。通过实验结果发现，实行亚低温后，大鼠海马CA2-CA3区中Cyt-C染色阳性的神经元数目与常温组相比明显减少，Bcl-XL和Bcl-XS的表达有所不同，Bcl-XL表达下降的时间后延，至损伤后7 d仍有表达；Bcl-XS于损伤后24 h开始增加，72 h达到峰值。这提示亚低温可减少Cyt-C释放，亚低温能够促进凋亡抑制基因Bcl-2的表达和抑制凋亡促进基因Bax的表达。参考文献[1]Busto R， Dietrich WD， Globus MY， et a1.Small difference in intraischemic brain temperature critically determine the extent of ischemic neuronal injury[J]. 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